ETD system

Electronic theses and dissertations repository

 

Tesi etd-10192016-123147


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
NIERI, DANIELA
URN
etd-10192016-123147
Title
Quantification of beta-caryophyllene tissue distribution upon oral and intraperitoneal administrations in a mouse model of ethanol induced liver injury
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott. Chicca, Andrea
relatore Prof.ssa Manera, Clementina
Parole chiave
  • beta-caryophyllene
  • CB2
  • LC-MS/MS
  • GC-MS
  • optimization
  • enzymatic assay
  • Endocannabinoid System
  • screening
Data inizio appello
09/11/2016;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il ∆9-tetraidrocannabinolo (THC) è il principale responsabile delle proprietà psicoattive della Cannabis Sativa. Solo nel 1990 il target cellulare del THC, responsabile dei suoi effetti biologici, è stato identificato e nominato recettore per i cannabinoidi di tipo 1 (CB1). Successivamente, un altro recettore per i cannabinoidi (di tipo 2, CB2), è stato identificato insieme ad una classe di lipidi che agiscono da ligandi endogeni per entrambi i recettori (endocannabinoidi). Nel corso degli anni, sono state identificati altri enzimi coinvolti nella sintesi/degradazione degli endocannabinoidi ed è stato così definito il “sistema endocannabinoide” (SEC). Il SEC è coinvolto in molti processi fisiologici e patologici a carico del sistema nervoso centrale (SNC) e del sistema immunitario. Come accennato precedentemente, il SEC è composto da due sottotipi recettoriali accoppiati a proteine G, di cui uno prevalentemente espresso nel SNC (CB1) e l’altro a livello dei tessuti periferici e sistema immunitario (CB2), i ligandi endogeni fra i quali i più studiati sono il 2-arachidonilglicerolo (2-AG) e N-arachidonil-etanolammina (anandamide, AEA) e gli enzimi deputati sia alla loro sintesi che alla loro degradazione, fra i quali spiccano il Diacylglycerol Lipase (DAGL) e Mono Acyl Glicerol Lipase (MAGL) per il 2-AG e il N-Acylphosphatidyl- Ethanolamine-Selective Phospholipase D (NAPE-PLD) e Fatty Acid Amide Hydrolase (FAAH) per l’AEA.<br>I vari componenti del SEC sono diventati target di molecole capaci di essere più o meno selettive verso di loro. In letteratura sono molti gli esempi di composti in grado di attivare in maniera specifica il recettore CB2 senza legarsi al recettore CB1, se non ad alte concentrazioni, evitando quindi gli effetti psicotropi tipici del THC. L’effetto farmacologico degli agonisti selettivi CB2 è stato dimostrato ad esempio in modelli animali d’infiammazione, del dolore ma anche nel danno ischemico a carico del rene e del fegato. Purtoppo per il momento non sono stati ancora identificati degli agonisti CB2 selettivi idonei ad essere testati nell’uomo in caso di malattie epatiche.<br>Tra le sostanze che però si legano selettivamente al recettore CB2 e si comportano da agonisti, viene riportato in letterature il β-cariofillene (BCP), un sesquiterpene presente negli olii essenziali di molte piante aromatiche, ed il maggior componente dell’olio essenziale della Cannabis, approvato anche come additivo alimentare dall’FDA.<br>Il mio lavoro di tesi, svolto presso il laboratorio del Prof. J. Gertsch all’Istituto di Biochimica e Medicina Molecolare dell’ Università di Berna (Svizzera), riguarda principalmente l’ottimizzazione di un metodo per la quantificazione del BCP in diversi tessuti (fegato, reni, siero, cuore e cervello) isolati da topi C57BL6, sacrificati a determinati intervalli di tempo (0-360min), dopo aver ricevuto il BCP per via intraperitoneale (i.p.) oppure per via orale (per os). Questo lavoro fa parte di un progetto più ampio, che intende valutare l’effetto protettivo del BCP in caso di danno epatico causato da assunzione cronica di alcool. Lo scopo principale del lavoro della mia tesi di laurea è stato quindi quello di valutare la cinetica di distribuzione tissutale del BCP dopo la sua somministrazione i.p. e per os. E’ stata inoltre valutata l’influenza di una dieta arricchita con un 5% di alcool per 10 giorni. La quantificazione del composto è stata effettuata utilizzando un metodo di gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS), molto più idoneo per tale fine rispetto alla più avanzata metodologia liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), in seguito all’ incapacità del BCP di ionizzarsi in modo ottimale. I risultati mostrano che in tutti i regimi di somministrazione del BCP testati, la concentrazione di BCP si riduce nel tempo nei tessuti, fino ad arrivare sotto il limite di detezione già dopo un’ora dalla somministrazione. Inoltre non è stato riscontrato nessun effetto significativo dell’assunzione cronica di alcool sulla cinetica di distribuzione tissutale del BCP (somministrato i.p.).<br>Abbiamo anche quantificato le concentrazioni tissutali di AEA, 2-AG, acido arachidonico, N-acetiletanolammine, progesterone, corticosterone e prostaglandine per valutare un eventuale effetto indotto dal BCP in modo indiretto su questi metaboliti. Questa quantificazione è stata effettuata utilizzando un metodo già riportato in letteratura e correntmente utilizzato nel laboratorio del Prof. J. Gertsch che sfrutta la metodologia LC-MS/MS. I risultati ottenuti mostrano che il BCP non induce variazioni significative sui metaboliti, con le eccezioni date dalla noladin etere che risulta ridotta nel fegato e del 2-AG e AEA che rispetto al controllo risultano aumentati nel rene e diminuiti nel cervello.<br>Un’ulteriore parte del lavoro della mia tesi ha riguardato la determinazione dell’attività farmacologica di 12 derivati del BCP sui principali componenti del SEC. Questi composti sono stati sintetizzati nel laboratorio del Prof. G. Appendino presso l’Università del Piemonte Orientale come parte di un progetto di collaborazione in essere con il gruppo del Prof. J. Gertsch. Uno studio precedente che ha valutato composti analoghi a quelli che ho testato, ha mostrato che derivati del BCP funzionalizzati con un gruppo ammidico presentano interessanti profili di polifarmacologia nel SEC, agedo da ligandi per il recettore CB2 e inibendo in modo selettivo alcuni degli enzimi responsabili del metabolismo degli endocannabinoidi (MAGL, FAAH, COX-2). I composti da me saggiati presentano nuove catene ammidiche rispetto a quelli già pubblicati. I risultati indicano una bassa affinità per il recettore CB2. Per quanto riguarda i saggi enzimatici invece, più composti hanno mostrato una certa attività inibitoria su uno o più enzimi. Nonostante ciò, i valori ottenuti delineano delle molecole che non presentano una spiccata selettività o potenza rispetto a quelle già riportate in letteratura. Infine, i saggi eseguiti per testare l’inibizione dell’uptake cellulare degli endocannabinoidi ad opera del putative endocannabinoid membrane transporter, hanno evidenziato due composti con valori di EC50 nel range del micromolare.<br>
File