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• next generation sequencing

Una delle principali caratteristiche dei tumori è quella di svilupparsi attraverso una progressione di vari stadi. E’ ormai noto che il cancro è caratterizzato da un accumulo nelle cellule di alterazioni genetiche. Ogni cellula del microambiente tumorale è costantemente in evoluzione durante il flusso della progressione tumorale. A tal proposito, sono stati identificati vari geni, nei modelli sperimentali, che promuovono la progressione. Resta, però, ancora poco nota l’associazione tra alterazione dell’espressione genica e alterazione a livello fenotipico con riguardo verso l’aggressività e il potenziale di migrazione delle cellule tumorali. Perciò investigare la correlazione genotipo-fenotipo diventa fondamentale per capire il complesso processo di progressione e di invasione.
Tutti i tumori hanno bisogno dello stroma per soddisfare i loro bisogni nutrizionali, strutturali e di rimozione dei rifiuti. E’ ormai chiaro che lo stroma sia essenziale per il mantenimento del tumore e per la sua crescita e che abbia un potenziale enorme come target terapeutico.
In questa tesi vogliamo osservare l’evoluzione cronologica dei cambiamenti dell’espresione genica a livello della struttura del microambiente tumorale nel cancro della mammella microinvasivo.
Abbiamo eseguito RNA-seq (tecnologia Ion Proton) su tre tumori alla mammella microinvasivi. Per ognuno abbiamo microdissecato 7 diverse porzioni del tumore (circa 200 cellule), 4 relative all’epitelio e 3 allo stroma. Le regioni sono state selezionate sulla base del loro grado di progressione. Quindi l’epitelio è stato cronologicamente diviso in: epitelio mammario normale (NBE), carcinoma in situ (CIS), digitazioni invasive iniziali (emerging invasive fingers, EIF) e tumore mammario invasivo (IBC). Per ognuna delle suddivisioni dell’epitelio mammario abbiamo microdissecato lo stroma (S) adiacente, eccetto per la porzione in situ: S-NBE, S-EIF e S-IBC.
L’analisi dell’intero trascrittoma di ogni regione microdissecata ha mostrato varie differenze a livello di espressione genica tra epitelio tumorale mammario e lo stroma. Il dendogramma mostra una perfetta organizzazione delle varie porzioni dei gruppi, esattamente in linea con le caratteristiche biologiche.
Analizzando con FunRich i geni significativi (p<0.05) derivanti dall’analisi di NGS delle varie porzioni, abbiamo identificato alcuni aspetti interessanti:
1) Confrontando S-IBC e S-NBE, abbiamo notato che i geni significativi sono principalmente coinvolti nell’apoptosi e nei meccanismi di rilascio delle citochine a livello del sistema immunitario.
2) Confrontando IBC e NBE vediamo che i geni fanno parte soprattutto dei meccanismi di riparo del DNA e dei pathways energetici.
3) Investigando la comunicazione tra le cellule epiteliali e lo stroma (IBC vs S-IBC) si può notare che i geni significativi sono coinvolti nel metabolismo e nei pathways energetici e le zone cellulari interessate sono i mitocondri e gli esosomi.
Questi ultimi dati in particolare sono i più interessanti in quanto ci aprono svariati scenari che perfettamente sono in linea con quanto presente in letteratura a livello del coinvolgimento del metabolismo nello sviluppo dei tumori (un esempio è rappresentato dal reverse effetto Warburg).
Inoltre abbiamo identifictao 2 geni interessanti: SYNGR2 (Synaptogyrin 2) and NNMT (Nicotinamide N-Methyltransferase). SYNGR2 codifica per una proteina vescicolare sinaptica la cui funzione è sconosciuta. NNMT invece catalizza la N-metilazione della nicotinamide e di altre piridine ed è altamente espresso in diversi tumori.
Nel nostro caso, SYNGR2 presenta un’alta espressione nel tessuto tumorale piuttosto che nel normale. A livello dello stroma non si ha espressione eccetto che per lo S-IBC.
Invece per quanto riguarda NNMT, diversamente da ciò che si legge in letteratura, noi troviamo una grande espressione nello stroma vicino al tumore (S-IBC) piuttosto che nelle cellule tumorali stesse e anche a livello del mioepitelio e dell’endotelio.
Ovviamente i nostri dati necessitano di ulteriori investigazioni a causa proprio della particolare popolazione presa in esame e tenendo in considerazione che stiamo considerando uno stadio precoce di malattia a livello del processo di invasione.
La grande mole di dati ottenuta tramite analisi NGS deve essere ancora analizzata per avere una chiara visione del flusso di eventi molecolari che partono dal tessuto normale mammario e arrivano allo stadio microinvasivo, questo soprattutto per capire meglio la comunicazione molecolare che esiste tra epitelio e stroma. Infine è importante sottolineare che grazie a questa analisi dei cambiamenti molecolari che avvengono a livello dell’epitelio mammario e dello stroma in un cancro mammario microinvasivo, si potrebbero sviluppare nuovi target terapeutici.