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Tesi etd-10152015-093404


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
PASSARINI, DALIA
URN
etd-10152015-093404
Title
Azione antiproliferativa del Carnosolo in cellule di glioblastoma multiforme umano: modulazione della funzione di p53
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
correlatore Dott.ssa Giacomelli, Chiara
Parole chiave
  • p53
  • Temozolomide
  • glioblastoma multiforme
  • induttori di apoptosi
  • fitoterapici
  • Carnosolo
Data inizio appello
11/11/2015;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
11/11/2018
Riassunto analitico
Il glioblastoma multiforme (GBM) rappresenta una delle forme più aggressive ed invasive di neoplasia che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Il GBM è classificato dalla OMS (Organizzazione Mondiale della Sanità) come un astrocitoma di quarto grado e, nonostante sia un tumore molto raro, rappresenta una delle forme più frequenti di tumore cerebrale e la sopravvivenza media dei soggetti colpiti si attesta intorno ai 12 mesi.
Il trattamento del glioblastoma prevede, quando possibile, in prima istanza l'asportazione chirurgica della lesione, seguita da radioterapia e chemioterapia (Temozolomide, agente alchilante il DNA). Nonostante questi interventi, è molto frequente la comparsa di recidive che sono legate all'elevata capacità infiltrativa nel tessuto sano adiacente, alla presenza di cellule staminali neoplastiche e all'aumento della resistenza all'apoptosi. L'apoptosi è uno dei meccanismi di controllo della trasformazione neoplastica adottata dalle cellule; una delle principali cause della sua inibizione è legata all'inattivazione della funzione della proteina p53. Nel GBM, l'inattivazione di p53, è principalmente causata non da una mutazione del gene TP53 (come si ha nel 50% dei casi di altre forme tumorali), ma dalla sovraespressione della proteina MDM2 (Murine Double Minute 2) che è il suo principale inibitore fisiologico.
MDM2 è una proteina di tipo E3 ubiquitina ligasi che esercita la sua funzione inibitrice attraverso un legame diretto a p53, inducendo la mono-ubiquitinazione e la conseguente fuoriuscita dal nucleo per essere degradata via proteasoma. Una sovraespressione di MDM2 determina una eccessiva degradazione di p53 con conseguente perdita della sua funzione di “controllore” del genoma e di promotore del processo apoptotico. Sulla base di queste evidenze, recentemente è aumentato l'interesse nella ricerca di molecole capaci di ripristinare la funzione di p53 attraverso la dissociazione del complesso p53/MDM2.
Nella ricerca di molecole capaci di indurre apoptosi tramite riattivazione della funzione di p53, sono stati prodotti e sviluppati molti composti di sintesi con varia struttura chimica. Tuttavia, negli ultimi anni, l'attenzione è stata rivolta verso i “phytochemicals”, composti bioattivi e non-nutritivi presenti in frutta, verdura e altri vegetali. L'interesse verso questa classe di composti è legato alla loro origine naturale, alla presenza in alimenti normalmente assunti con la dieta ed alla loro minore tossicità verso le cellule sane che riduce l'insorgere di effetti collaterali o di patologie secondarie. Ai phytochemicals appartengono varie classi di molecole tra cui spiccano i polifenoli e i diterpeni. Questi composti hanno dimostrato di possedere proprietà antiossidanti, antiinfiammatorie, antivirali, neuro- immuno- e cardioprotettive e antitumorali verso vari tipi di tumore.
In questo lavoro di tesi è stato preso in esame il Carnosolo (CA), un diterpene contenuto in grandi quantità nell'estratto di rosmarino (Rosmarinus Officinals) ed in altre piante aromatiche della famiglia delle Lamiaceae. Il Carnosolo ha proprietà: antiossidanti, antiinfiammatorie, neuroprotettive, antiangiogeniche, antimetastatiche e antitumorali. La sua capacità antitumorale è stata ampiamente dimostrata sia in saggi in vitro, verso varie linee cellulari, che in vivo, tuttavia ad oggi non sono stati riportati dati sulla sua attività nel GBM.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l'azione antitumorale del CA in cellule U87MG, un modello sperimentale di GBM. Il CA è risultato capace di diminuire la vitalità delle cellule tumorali, inoltre questa diminuzione è stata correlata ad un concomitante blocco del ciclo cellulare e aumento dell'apoptosi.
Sulla base dei dati ottenuti, è stato quindi indagato il meccanismo con cui CA induce apoptosi e, in particolare, è stato valutato se l'effetto antiproliferativo fosse dovuto, almeno in parte, alla riattivazione della funzione di p53. Il CA è risultato capace di aumentare i livelli intracellulari di p53. Questo effetto può essere attribuito a due principali meccanismi: la sintesi de novo della proteina o la diminuzione della sua degradazione tramite la dissociazione diretta del complesso p53/MDM2. Il CA è stato dimostrato non interferire né sulla trascrizione genica di p53 né sulla sua sintesi, bensì è risultato capace di dissociare direttamente il complesso p53/MDM2, come dimostrato tramite un dosaggio immunoenzimatico “home made”. Inoltre, il fitoterapico, oltre ad aumentare l'espressione di p53, ne potenzia la sua attività come dimostrato mediante l'analisi della trascrizione dei geni target della proteina.
Oltre alla scoperta di composti utilizzabili nella terapia diretta del tumore, recentemente è aumentato l'interesse nella scoperta di agenti capaci di sensibilizzare le cellule tumorali all'azione dei chemioterapici standard. Per vedere se il CA fosse capace di sensibilizzare le cellule di glioblastoma alla terapia standard, è stato valutato l'effetto sinergico del co-trattamento con Temozolomide. Dall'analisi isobolografica, il CA è risultato capace di aumentare l'azione antiproliferativa del chemioterapico con un effetto di tipo sinergico.
Dai risultati ottenuti possiamo quindi concludere che il CA è in grado di esercitare un effetto antiproliferativo verso cellule di GBM e che questa azione è dovuta al ripristino della funzione della proteina p53. Inoltre, visto l'effetto sinergico con i chemioterapici standard, il CA può essere considerato anche un promettente agente sensibilizzante nella terapia antitumorale del GBM.
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