• glioblastoma multiforme umano
• MDM2
• p53

Il glioblastoma multiforme (GBM; WHO grado IV), è il tumore più maligno del sistema nervoso centrale e particolarmente resistente alla terapia attualmente in uso, che consiste nella esposizione a radiazioni ionizzanti e trattamento con farmaci alchilanti del DNA. Esistono varie cause alla base della radio/chemoresistenza dei GBM, tuttavia uno dei fattori che riveste un ruolo cruciale è rappresentato dall'inattivazione della funzione del principale “gatekeeper” cellulare, p53. In condizioni normali, in seguito a danno del DNA, p53 blocca il ciclo cellulare e può innescare il programma di morte cellulare. In una piccola percentuale di gliomi, p53 presenta sostituzioni aminoacidiche causate da mutazioni nel gene che lo codifica, le quali determinano la perdita di attività di p53. Nella maggior parte dei casi, i gliomi mantengono p53 con una sequenza aminoacidica normale (p53 wild-type) ma la funzione di p53 è inibita da un inappropriato aumento di attività del suo principale inibitore intracellulare, l’oncoproteina MDM2 (Murine Double Minute 2).
Recentemente sono state introdotte delle molecole sintetiche che, legandosi al sito per p53 presente nella proteina MDM2, impediscono la formazione del complesso MDM2-p53. Di conseguenza, p53 non essendo più inibito da MDM2 può esercitare la sua funzione di soppressore tumorale. L’uso di queste molecole sintetiche è risultato efficace a riattivare la funzione di p53 in vari tipi di cancro, sia in studi in vitro che in vivo. Molecole sintetiche chiamate Nutline sono state le prime ad essere state introdotte (Vassilev et al., 2004) e attualmente Nutlina-3 è usata nella sperimentazione in studi clinici per il trattamento di alcuni tumori solidi. Nonostante siano stati effettuati molti studi con tali molecole, poco si sa sulla loro efficacia per il trattamento di cellule di GBM.
In questo lavoro di tesi è stato valutato l’effetto di una nuova molecola sintetica, appartenente alla famiglia delle spiro(ossindol-3-3'-tiazolidine) e chiamata ISA27, sulla crescita in vitro di un modello cellulare di GBM umano (cellule U87MG). Inoltre sono stati studiati i meccanismi intracellulari attivati in seguito al trattamento delle cellule U87MG con ISA27.
Parallelamente tutti gli esperimenti sono stati effettuati utilizzando Nutlina-3 come standard di riferimento.
In esperimenti precedenti condotti nel nostro laboratorio è stato evidenziato che una dose più bassa di ISA27, rispetto a quella di Nutlina-3, è in grado di inibire il 50% della vitalità (IC50) delle cellule U87MG dopo 24 h di trattamento. Inoltre, alla dose di IC50 entrambe le molecole sintetiche inducono una inibizione della crescita cellulare in maniera tempo-dipendente per un trattamento di 5 giorni. Nel presente lavoro, le cellule U87MG sono state trattate alla concentrazione di IC50 di ISA27 o di Nutlina-3 per 5 giorni ed è stato valutato se il trattamento con tali molecole induceva un blocco della progressione del ciclo cellulare in maniera reversibile o irreversibile e se attivava il programma di morte cellulare apoptotico.
Abbiamo trovato che ISA27 e Nutlina-3 inducono un blocco del ciclo cellulare irreversibile. Infatti, al microscopio le cellule U87MG si presentano più grandi e piatte, morfologia tipica del blocco irreversibile, chiamato anche senescenza cellulare. Inoltre esprimono il marker di senescenza beta-galattosidasi. Oltre alla induzione della senescenza cellulare, ISA27 attiva il programma di morte apoptotica già a partire dalle 24 h di trattamento. Dopo tale tempo di incubazione abbiamo evidenziato un incremento dei livelli di espressione di mRNA per la proteina PUMA, dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale e rilascio di citocromo c dal mitocondrio, tutti parametri cellulari apoptotici. In accordo con i dati di letteratura anche Nutlina-3 induce apoptosi ma i parametri apoptotici iniziano a comparire nelle fasi tardive del trattamento.
Sono stati inoltre eseguiti degli esperimenti per testare l’effetto dei trattamenti degli inibitori MDM2 sulla vitalità di un modello di cellule normali, rappresentato da linfomonociti umani.
I risultati hanno evidenziato una mancanza di citotossicità sia di ISA27 che Nutlina-3 su questo modello normale di cellule periferiche.