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I neuroni del sistema serotoninergico nei mammiferi sono generati a stadi precoci dello sviluppo embrionale nella porzione ventrale del rombencefalo e, successivamente, danno origine a nuclei distinti denominati nuclei del raphe le cui proiezioni raggiungono tutto il sistema nervoso centrale anteriore ed il midollo spinale. La specificazione di tali neuroni è determinata da una combinazione di fattori di trascrizione e molecole di secrezione quali Shh, Fgf4/8, Nkx2.2, Lmx1b e Pet1. Tra questi, il gene codificante per il fattore di trascrizione Pet1 è l’unico che nel sistema nervoso centrale (SNC) mostra un’espressione ristretta esclusivamente ai precursori serotoninergici. Nel topo Pet1 è trascritto a partire dall’undicesimo giorno di gestazione (11 days post coitum, dpc), circa un giorno prima della comparsa della serotonina, ed è mantenuto attivo nei neuroni serotoninergici dell’adulto dove promuove l’espressione dell’enzima chiave per la sintesi della serotonina nel SNC, la triptofano idrossilasi 2 (Tph2).
Nel corso degli ultimi anni la crescente disponibilità di linee transgeniche di topo in grado di esprimere geni reporter in maniera inducibile in seguito a ricombinazione somatica mediata dalla ricombinasi Cre ha offerto la possibilità per un approccio alternativo dello studio dell’espressione genica in vivo (www.gensat.org). Questo approccio sperimentale, che prevede la combinazione di due o più linee transgeniche ad hoc (transgenesi binaria), rende possibile la visualizzazione di specifiche popolazioni di neuroni e la formazione delle proiezioni assonali durante lo sviluppo del SNC.
Recentemente, in laboratorio sono state generate 4 distinte linee transgeniche di topo impiegando un frammento genomico di circa 210 kb corrispondente al locus del gene Pet1 contenuto in un cromosoma batterico artificiale (BAC) ingegnerizzato allo scopo di far esprimere la ricombinasi Cre con le stesse caratteristiche di espressione sia spaziali sia temporali del gene Pet1. Tuttavia, dato che per la generazione della linea transgenica è stata introdotta nel BAC una cassetta di selezione esprimente il gene neo il quale potrebbe interferire con il normale controllo trascrizionale del gene Pet1 e poiché l’integrazione di un transgene avviene in maniera casuale all’interno del genoma dell’organismo ospite con la possibile comparsa di artefatti noti con il termine di “positional effect”, è necessario, pertanto, analizzare il profilo di espressione spazio-temporale del transgene e valutare se questo ricapitoli quello del gene endogeno.


Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare il profilo spazio/temporale di espressione della ricombinasi Cre nelle 4 linee transgeniche Pet1/Cre. Per questo, ho utilizzato le linee transgeniche Pet1/Cre in combinazione con la linea reporter ROSA26R, in cui l’espressione del gene reporter β-galattosidasi, è inibita dalla presenza di una cassetta di stop compresa tra due siti loxP (floxata). L’attivazione tessuto-specifica della ricombinasi Cre media un evento di ricombinazione somatica conservativa in seguito al riconoscimento dei siti loxP e porta alla eliminazione della cassetta di stop e alla conseguente espressione del gene reporter nelle cellule in cui è avvenuto l’evento di ricombinazione. Dall’incrocio di queste due distinte linee transgeniche ho potuto analizzare l’espressione del gene reporter mediante una reazione cromogenica per la β-galattosidasi negli embrioni positivi per entrambi i transgeni a diversi stadi di sviluppo sia embrionale, a partire da 12.5 “days post coitum” (dpc), sia post-natale.
Successivamente, le 4 linee Pet1/Cre sono state incrociate con una linea transgenica flp per rimuovere la cassetta di selezione esprimente il gene neo, e sono state denominate Pet1/Cre/neo- per distinguerle dalle originali Pet1/Cre/neo+. I dati finora ottenuti mostrano che l’espressione della ricombinasi Cre nei nuclei del raphe riflette quella del gene Pet1, sia nella linea Pet1/Cre/neo- sia nella linea Pet1/Cre/neo+ seppur con un certo grado di variabilità e, in entrambi i casi, ho riscontrato la presenza di un certo grado di espressione ectopica in alcune regioni del cervello che, per tre delle quattro linee, si evidenzia già a stadi embrionali precoci. Al momento, sono in corso esperimenti per caratterizzare in maniera fine le variazioni causate dalla rimozione della cassetta esprimente il gene neo.
L’impiego di questo sistema per lo studio dell’espressione genica mediante la visualizzazione del gene reporter β-galattosidasi ha permesso di ipotizzare la presenza di nuovi domini di espressione per il gene Pet1 al di fuori del sistema serotoninergico e non descritti precedentemente. In particolare, ho riscontrato la presenza di espressione del gene reporter in organi quali il rene e l’intestino. Poiché, Pet1 precede l’espressione di geni che individuano il fenotipo serotoninergico quali Tph2 sto conducendo esperimenti di ibridazione in situ con sonde specifiche per i geni Pet1, Cre, β-gal, Tph2 e Tph1 allo scopo di caratterizzare più in dettaglio l’espressione del transgene Pet1/Cre in modo da valutare se anche in questi tessuti l’espressione di Pet1 prelude all’acquisizione di un fenotipo serotoninergico nei domini in cui è espresso il gene reporter.
Queste linee transgeniche, una volta caratterizzate accuratamente, permetteranno di mettere in evidenza e di selezionare i precursori dei neuroni serotoninergici per generare una banca di cDNA specifica per questa popolazione per effettuare saggi di differenziamento in vitro impiegando un approccio di “expression cloning” ed individuare nuovi fattori che regolano lo sviluppo del fenotipo serotoninergico.