• aptameri
• SELEX

Questo lavoro di tesi sperimentale, svolto nel Laboratorio di Tecnologie Genomiche presso l’Istituto di Fisiologia Clinica del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Pisa, verte sullo sviluppo di un metodo di selezione di aptameri a base di DNA per il riconoscimento dell’aminoacido fosfotirosina. Il lavoro effettuato si inserisce all’interno di un progetto di ricerca volto allo studio del profilo di fosforilazione di campioni proteici ed ha la finalità di fornire un innovativo strumento di affinità per arricchire l’estratto proteico con specie fosforilate, destinate ad analisi in spettrometria di massa.
Gli aptameri sono oligonucleotidi a singolo filamento, di DNA o di RNA, in grado di legare con elevata affinità e specificità una vasta gamma di molecole bersaglio, quali proteine o altre molecole organiche e inorganiche. L’insieme dei ripiegamenti secondari, a carico di porzioni multiple della molecola, porta alla formazione di una struttura tridimensionale complessa che fornisce una geometria utile ad una salda interazione con la superficie della molecola bersaglio. Gli aptameri sono generati da un processo di selezione in vitro chiamato SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Questa tecnologia si basa sul vaglio di collezioni combinatorie di oligonucleotidi mediante un processo iterativo di selezione ed amplificazione “in vitro”, al fine di generare aptameri dotati di elevata specificità e selettività verso il bersaglio scelto.
Partendo da una collezione combinatoria, costituita da una vasta popolazione di oligomeri a sequenza casuale, abbiamo effettuato 12 cicli di selezione i cui passaggi consistono: 1) nella interazione delle sequenze con il bersaglio, 2) nel recupero delle molecole affini 3) nell’amplificazione mediante PCR delle specie recuperate. Successivamente, abbiamo sub-clonato in un vettore plasmidico gli oligonucleotidi, selezionati con la tecnica SELEX e il vettore ricombinante è stato introdotto in cellule di Escherichia coli .
I cloni batterici, ottenuti dalle colture batteriche dopo trasformazione, contenti ciascuno una sola delle sequenze che compongono la miscela selezionata, possono essere sottoposti a sequenziamento da cui sarà possibile ricavare la sequenza nucleotidica delle specie affini al bersaglio. Dopo ulteriori studi di binding per la valutazione dell’affinità e della specificità per il bersaglio fosfotirosina, dalle sequenze ottenute dal sequenziamento si ricaverà l’aptamero da impiegare nelle applicazioni proteomiche sopracitate.
Nel corso dell’attività svolta, ci siamo concentrati prevalentemente sulla messa a punto di un protocollo di selezione semplice e funzionale, la cui validità può essere estesa anche alla selezione di aptameri a DNA, destinati ad altri target molecolari.
La scelta della tipologia di acido nucleico da impiegare per la selezione è ricaduta sul DNA in quanto è meno suscettibile alla degradazione enzimatica rispetto all’ RNA e quindi più idoneo all’interazione con i campioni biologici nelle applicazioni a cui è destinato. Inoltre, il ridotto numero di passaggi richiesti nel processo SELEX, per l’oligonucleotide a DNA, ha permesso di snellire il lavoro in corso e bypassare molte criticità che si sono presentate in passato per selezioni di aptameri ad RNA.
Ogni tappa della procedura SELEX è stata analizzata, focalizzandone i principi teorici e costruendo su di essi le idee progettuali sperimentate. In particolare, sulla base della collezione combinatoria scelta come punto di partenza per il processo di selezione, abbiamo progettato e poi sintetizzato i primer necessari all’amplificazione delle specie della collezione affini al target, fissando preliminarmente le condizioni sperimentali di PCR idonee all’ottenimento di un buon prodotto di amplificazione. L’introduzione di opportuni sistemi di marcatura sui primer ha consentito da un lato il monitoraggio dell’intero processo, e dall’altro la separazione dei filamenti complementari ottenuti per amplificazione. Infatti, poichè l’interazione con il bersaglio molecolare sia realizzabile, l’acido nucleico impiegato per la selezione deve essere a singolo filamento; una strategia di separazione del doppio filamento è dunque essenziale per poter effettuare la selezione di aptameri a DNA.
Le molecole di acido nucleico, a sequenza casuale, sono state così messe a contatto con il bersaglio molecolare, precedentemente immobilizzato ad una matrice solida di natura polimerica. In questo modo le sequenze dotate di bassa o trascurabile affinità sono rimaste in soluzione, mentre le specie affini rimaste adese alla matrice di selezione insieme al target sono state recuperate ed amplificate, per essere utilizzate nel ciclo di selezione successivo. La strategia che prevede l’immobilizzazione della molecola bersaglio su un supporto solido, può essere estesa ad un gran numero di altri bersagli molecolari. In modo particolare, risulta utile per piccole molecole per le quali non sono disponibili metodi alternativi a consentire la separazione delle sequenze che hanno interagito con il bersaglio da quelle non legate.
Gradualmente, nel corso del processo, le condizioni di interazione delle sequenze con il bersaglio sono diventate sempre più selettive per favorire la formazione di legami a più alta affinità.
L’efficacia del processo di clonaggio, volto a separare ogni singola specie della collezione ottenuta dall’ultimo ciclo di selezione, è stata infine provata sottoponendo ad amplificazione i diversi cloni delle colonie ottenute. L’impiego dei primer specifici per la collezione ha permesso, l’amplificazione selettiva delle sequenze di interesse.
Questa tesi costituisce dunque l’inizio di un ambizioso progetto che ha come fine ultimo l’impiego di un aptamero, quale strumento di separazione per applicazioni proteomiche.