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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-10102011-131112


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
CUCCO, FRANCESCO
URN
etd-10102011-131112
Titolo
Biomarcatori di apoptosi in un modello sperimentale di obesità
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Dott.ssa Giannessi, Daniela
correlatore Prof. Cercignani, Giovanni
correlatore Dott.ssa Garcia Gil, Maria De Las Mercedes
Parole chiave
  • tessuto cardiaco
  • tessuto adiposo
  • obesità
  • apoptosi
Data inizio appello
27/10/2011
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
27/10/2051
Riassunto
RIASSUNTO

Introduzione: Negli ultimi anni obesità e diabete hanno raggiunto proporzioni epidemiche nei paesi occidentali, focalizzando l’attenzione sulle relazioni che intercorrono tra adiposità, infiammazione, alterazioni metaboliche e sviluppo di malattie croniche, quali quelle cardiovascolari. Nello sviluppo e progressione delle malattie cardiovascolari, l’apoptosi del cardiomiocita ha un ruolo critico e questo processo è aumentato nell’obesità, principalmente per fenomeni di lipotossicità (lipoapoptosi).
Scopo: Scopo di questo lavoro di tesi è quello di valutare come obesità e diabete influenzino il processo apoptotico nel miocardio e nel tessuto adiposo, determinando l’espressione, a livello di mRNA, di biomarcatori pro- e anti-apoptotici in modelli sperimentali animali di obesità/diabete e in opportuni gruppi di controllo.
Metodi: Sono stati studiati 4 gruppi (n = 10 ciascuno) di ratti Zucker maschi: 1. obesi (fa-/fa-); 2. controlli magri (fa+/fa+ e fa+/fa-); 3. ZDF (obesi diabetici); 4. ZDF controlli magri. Dopo valutazione della perfusione e dell’uptake di glucosio tramite tomografia a emissione di positroni a livello dei principali organi, questi sono stati prelevati e conservati a -80°C. Nel tessuto cardiaco è stata valutata l’espressione di Caspasi(Casp)-3, Casp-8, Casp-9, Bid e di fattori anti-apoptotici come Hsp72 e Bcl-2. Lo studio è stato completato con la valutazione di Interleuchina (IL)-6 e Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, citochine infiammatorie coinvolte nella regolazione dell’apoptosi. In un sottogruppo di animali, la stessa analisi è stata effettuata nel tessuto adiposo viscerale. L’espressione dei biomarcatori è stata valutata tramite analisi Real-Time PCR, usando per la normalizzazione tre geni di riferimento specifici per i tessuti in oggetto. L’integrità del DNA è stata valutata su tutti i campioni, sia cardiaci che adiposi.
Risultati: Per ciascuno dei geni di interesse sono state determinate le condizioni ottimali di reazione e sono stati selezionati nei diversi tessuti i geni di riferimento più stabili nel nostro modello sperimentale. Per il tessuto cardiaco i geni di riferimento selezionati sono HPRT-1, SDHA, TBP scelti da un più ampio gruppo di geni di riferimento. Per il tessuto adiposo i geni di riferimento selezionati sono HPRT-1, TBP, TFRC. Nel tessuto adiposo è stato osservato un aumento significativo delle citochine infiammatorie negli animali obesi rispetto ai controlli (IL-6: p = 0,017; TNF: p = 0,041). Per quanto riguarda i fattori pro-apoptotici, si osserva un aumento significativo della Casp-3 negli obesi rispetto ai controlli (p = 0,004), mentre per quelli anti-apoptotici si osserva un aumento significativo di Bcl-2 negli obesi rispetto ai controlli (p = 0,049). Nel tessuto cardiaco si osserva un aumento significativo della Casp-3 e del Bid nei soggetti diabetici rispetto agli obesi (p = 0,031; p < 0,001). Per quanto riguarda i fattori anti-apoptotici, Hsp72 aumenta significativamente nei diabetici rispetto ai relativi controlli ed agli obesi (p = 0,027; p = 0,0033). Il DNA Laddering è risultato negativo per tutti i campioni in entrambi i tessuti.
Conclusioni: Questi risultati indicano che i principali fattori pro-apoptotici sono attivati in questi modelli sperimentali di obesità e diabete, così come lo sono i rispettivi sistemi di controllo, sia a livello del tessuto cardiaco che adiposo. La possibilità di modulare il bilancio fra mediatori e inibitori di apoptosi potrebbe rappresentare un importante obiettivo per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici rivolti a ridurre la progressione di questo processo, coinvolto in molte patologie associate con l’obesità.


ABSTRACT

Introduction: Obesity and diabetes is reaching epidemic proportions in Western countries, focusing on the relationships between obesity, inflammation, metabolic disorders and development of chronic diseases such as cardiovascular disease. In the development and progression of cardiovascular disease, apoptosis of cardiomyocyte plays a critical role in obesity and this process has increased, mainly due to lipotoxicity effects (lipoapoptosis).
Purpose: The purpose of this thesis is to evaluate how obesity and diabetes affect the apoptotic process in the myocardium and adipose tissue. For this, the expression at the level of mRNA of biomarkers pro- and anti-apoptotic was evaluated in animal experimental models of obesity/diabetes and in relative control groups.
Methods: We studied 4 groups (n = 10 each) of male Zucker rats: 1. obese (fa-/fa-), 2. lean controls (fa + / + and it is + / fa-), 3. ZDF (obese diabetic), 4. Lean ZDF controls. After evaluation of perfusion and glucose uptake at the level of major organs using positron emission tomography, tissues were collected and stored at -80° C. In cardiac tissue the expression of Caspase (Casp) -3, Casp-8, Casp-9, Bid and anti-apoptotic factors such as Hsp72 and Bcl-2 were determined. The study was completed with the determination of interleukin (IL) -6 and tumor necrosis factor (TNF)-α, inflammatory cytokines involved in the apoptosis regulation. In a subgroup of animals, the same analysis was carried out in visceral adipose tissue. The expression of biomarkers was evaluated by real-time PCR analysis, using three reference genes for each tissue for normalization of experimental data. The DNA integrity was evaluated in all cardiac and fat samples.
Results: The optimal conditions of reaction were determined for each studied gene and the three most stable housekeeping genes for the two tissues of our experimental model were selected. For heart tissue reference genes selected were HPRT-1, SDHA, TBP, chosen from a reference group of genes. For the adipose tissue reference genes were HPRT-1, TBP, TFRC. In adipose tissue a significant increase in inflammatory cytokines in obese animals compared with controls was observed (IL-6: p = 0.017, TNF: p = 0.041). Among the pro-apoptotic factors a significant increase in Casp-3 in obese compared to controls is observed (p = 0.004), while as to the anti-apoptotic ones, Bcl-2 significantly increased in obese animals compared to controls (p = 0.049). In the cardiac tissue a significant increase in Casp-3 and Bid was observed in diabetic subjects compared to obese ones (p = 0.031, p <0.001, respectively). As to the anti-apoptotic factors, Hsp72 increases significantly in diabetics with respect to controls and to obese animals (p = 0.027, p = 0.0033, respectively). No fragmentation of DNA was found, by DNA laddering experiments, in all samples of both tissues.
Conclusions: These results indicate that the main pro-apoptotic factors are activated in these experimental models of obesity and diabetes, as well as the respective control systems, both in the cardiac and adipose tissue. The possibility to modulate the ratio between pro- and anti-apoptotic factors could be an important target for the development of new treatments aimed at reducing the progression of the apoptosis, a process involved in obesity-linked diseases.


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