• Comparabilità
• Convalida
• Intermedi
• Prodotti finiti
• TnBP

L’obiettivo del lavoro di tesi è verificare che il metodo analitico per la determinazione quantitativa del TnBP (Tri-normal-butilfosfato) in campioni intermedi di purificazione e prodotti finiti, e convalidato sul sistema gascromatografico(Giver- GCR-002) Autosystem XL Perkin Elmer, possa essere trasferito sul sistema gascromatografico(Receiver-GCR-302) Clarus590 Perkin Elmer, senza compromettere lo stato di validazione della metodica. Gli strumenti coinvolti nello studio sono da considerarsi equivalenti in relazione alle specifiche tecniche. Tale studio è atto a dimostrare l’assenza di impatto sullo stato di validazione della metodica analitica in seguito all’applicazione su sistema GCR-302, permettendone l’implementazionesenza alcuna variazione regolatoria ai dossier di registrazione dei prodotti.
Tale lavoro di tesi è stato svolto presso il Laboratorio QC- Chimica e Collaudi dell’azienda farmaceutica Kedrion Biopharma S.p.A.
Il TnBP è una solvente che trova applicazione negli step di inattivazione viraledel plasma e dei suoi derivati, al fine di inattivare possibili agenti virali che non sono comunemente rilevati nelle fasi di screening delle donazioni di plasma. Tale sostanza presente nelle fasi di purificazione (step di inattivazione virale) deve successivamente essere rimossa e ne deve essere certificato il residuo nel prodotto finito secondo linea guida ICH Q3C. A tal fine, i laboratori QC Kedrion hanno sviluppato e validato due metodiche analitiche per la determinazione quantitativa del TnBP nelle differenti fasi di processo (step di inattivazione e residui su prodotto finito). Entrambe le metodiche prevedono la determinazione quantitativa di TnBP per gascromatografia ad iniezione diretta attraverso estrazione liquido-liquido dell’analita utilizzando Isopropanolo (2-propanolo) e lo standard interno TPP (tripropilfosfato). L’estratto ottenuto è direttamente sottoposto ad analisi gascromatografica per gli intermedi degli step di purificazione, mentre per i prodotti finiti è sottoposto a essicazione in corrente d’aria e successiva risospensione in esano.
L’estratto, in seguito ad iniezione, viene separatoutilizzando una colonna gascromatografia capillare MEGA SE54, ed elio come gas di trasporto, permettendola separazione degli analiti sulla base di una diversa interazione che questi hanno con la fase stazionaria (polimetil-fenil-silossano) e della rampa di temperatura applicate. La determinazione degli analiti è eseguita tramite rilevatore FID (Flame Ionization Detector) alimentato ad Aria e Idrogeno.
La determinazione quantitativa del TnBP è eseguita per regressione lineare sulla base di una curva di calibrazione generata dal rapporto di soluzioni standard di analita e standard interno (standardizzazione interna). Tale analita è determinato in funzione della propria concentrazione.
Al fine di dimostrare la comparazione dei dati ottenuti mediante applicazione del metodo sui 2 sistemi gascromatografici GCR-002 e GCR-302,differenti tipologie di campioni (matrici) sono state oggetto dello studio:
- Intermedio dello step di inattivazione virale del processo di purificazione Fattore IX/PTC: Campione E2
- Intermedio dello step di inattivazione virale del processo di purificazione Fattore VIII: Campione O4
- Intermedio dello step di inattivazione virale del processo di purificazione Immunoglobulina 5% Endovena: Campione IGV3
- Prodotto Finito Fattore VIII.
- Prodotto Finito Fattore IX/PTC.
- Prodotto Finito Immunoglobuline Endovenose 5%.
In conformità alle linee guida (1), al fine di verificare la comparabilità dell’applicazione del metodo è necessario:
• eseguire test di Comparabilità: se la popolazione dei dati mostra una distribuzione Gaussiana (test di Anderson-Darling od equivalente) si procede con l’applicazione del test t-TOST (test parametrico). Nel caso in cui, i dati a disposizione non risultino avere una distribuzione normale, si applica il test Mann-Whitney e il test delle Mediane (test non-parametrici).
• riverificareil limite di quantificazione (LOQ), nel caso di test quantitativo di limite: verifica dei criteri di Accuratezza e Precisione sullo strumento Receiver, in relazione al valore di LOQ convalidato sullo strumento Giver.
Per verificare la comparazione dei risultati è stato analizzato un pool, in sestuplicato, per ogni tipologia di campione (matrice) sia sullo strumento Giver (GCR-002) che sullo strumento Receiver (GCR-302), applicando le condizioni cromatografiche convalidate. Al termine delle prove la comparabilità dei dati prodotti dai due strumenti è stata verificata statisticamente attraverso test di equivalenza.
I dati ottenuti dall’analisi dei campioni intermedi di purificazione hanno mostrato una distribuzione normale per entrambe le popolazioni di dati (Giver e Receiver) in relazione alle differenti matrici (E2/O4/IGV3)permettendo l’applicazione del test di equivalenza t-TOST che ha restituito esito Conforme (α 0,05; θ ±5%).
I dati ottenuti dall’analisi dei campioni di Prodotti Finiti Immunoglobulina endovenosa 5% e Fattore VIII hanno mostrato una distribuzione normale per entrambe le popolazioni di dati (Giver e Receiver) in relazione alle differenti matrici permettendo l’applicazione del test di equivalenza t-TOST che ha restituito esito Conforme (α 0,05; θ ±5%).
I dati ottenuti dall’analisi dei campioni di Prodotti Finiti Fattore IX/PTC ha mostrato una distribuzione non normale, per tale ragione sono stati applicati test di equivalenza non parametrici che hanno restituito esito Conforme (α 0,05; θ ±5%).
La parte finale del progetto ha visto la riverifica del valore di LOQ sul nuovo gascromatografo GCR-302. Il limite di quantificazione è un’importante caratteristica del metodo analitico che identifica il limite inferiore di concentrazione sotto il quale il campione non può essere quantificato in modo accurato e preciso. In questo studio è stato verificato il limite convalidato di LOQ= 0.2ppm (parti per milione; mg/l). La prova ha previsto l’analisi di un campione a titolo noto (0.2ppm), in triplicato, in 3 sedute analitiche indipendenti e la verifica del rispetto dei criteri di accettabilità:
• accuratezza: ±10%
• precisione: CV% ≤5%
I dati ottenuti hanno confermato il valore di LOQ come accurato e preciso.
Al termine di queste prove è stato confermato l’esito positivo dello studio di comparabilità dei due metodi permettendo l’implementazione del sistema GCR-302 per la determinazione del TnBP in test di rilascio di Intermedi e Prodotti Finiti.









(1) Analytical procedures and methods validation for drugs and biologics;Guidance for industry; FDA CBER CDER July 2015