• saggio di neutralizzazione
• anticorpi neutralizzanti
• HCV
• vettori MLV-derivati

Il virus dell'epatite C (HCV) è un virus di piccole dimensioni dotato di pericapside, di una molecola di RNA a filamento singolo con polarità positiva e appartenente alla famiglia delle Flaviviridae. Esso replica prevalentemente negli epatociti causando un danno epatico cronico che può portare allo sviluppo di epatite cronica, cirrosi del fegato ed epatocarcinoma. HCV evoca una risposta immunitaria sia cellulo-mediata che umorale che tuttavia non sembra essere in grado di eradicare l’infezione e impedire la progressione della malattia. Ancora poco chiaro è il ruolo protettivo svolto dagli anticorpi neutralizzanti (nAb), capaci di legare i recettori di HCV (le glicoproteine E1 ed E2 dell’envelope) e di bloccarne quindi l’ingresso nelle cellule target.
Il progetto di tesi si è incentrato sull’allestimento di un test di neutralizzazione con il quale misurare anticorpi ad attività neutralizzante in sieri di pazienti infetti da HCV. A tal fine e in conseguenza dell’impossibilità di propagare HCV in vitro, sono state generate particelle virali pseudotipizzate con le glicoproteine E1 ed E2 dell’envelope di HCV. Il sistema vettore utilizzato è basato sul virus della leucemia murina (MLV) ed è costituito da tre plasmidi: un costrutto di packaging esprimente i geni Gag e Pol necessari per l’espressione delle proteine strutturali ed enzimatiche del virus; un costrutto vettore contenente il segnale di incapsidamento che presenta una cassetta di espressione per la green fluorescent protein (GFP); infine un costrutto envelope codificante per le glicoproteine di superficie E1 ed E2 di HCV. Nel nostro caso sono stati utilizzati costrutti con E1 ed E2 di due genotipi differenti (1a e 3a). In modo analogo e sostituendo il solo costrutto envelope, sono state prodotte anche particelle pseudotipizzate con la proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV). VSV-G utilizza come recettore un fosfolipide di membrana cellulare presente in modo ubiquitario ed utilizzato quindi come controllo di funzionalità delle particelle vettore. I costrutti sono stati prodotti in una linea di fibroblasti renali embrionali umani e le particelle prodotte utilizzate per l’infezione della linea Huh-7 derivata da epatocarcinoma umano su cui è allestito il saggio di neutralizzazione. Questo consiste nell’impiego di quantità fisse di pseudovirus incubate con diluizioni scalari del siero da testare, permettendo così il legame tra gli nAb eventualmente presenti ed E1-E2; le miscele poi sono state messe a contatto con cellule Huh-7. Dopo settantadue ore i campioni sono stati analizzati al citofluorimetro per contare le cellule trasdotte, riconoscibili perché GFP-positive. Infine è stata quindi calcolata la riduzione del numero di cellule fluorescenti nei campioni incubati con il siero rispetto ai controlli, ovvero cellule incubate con il solo vettore. L’attività neutralizzante del campione è espressa come riduzione percentuale di fluorescenza dei campioni rispetto ai controlli.