• HN9.10e
• interazioni proteina-proteina
• Kidins220/ARMS
• PDZRN3/VSP

Kidins220 (Kinase D-Interacting Substrate of 220kDa) è una proteina molto conservata nei metazoi; essa è espressa prevalentemente nelle cellule nervose in cui sembra svolgere un ruolo importante durante il differenziamento.
Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che Kidins220 interagisce con la proteina PDZRN3/VSP (ventral eye staining protein). Il gene vsp è stato caratterizzato in embrioni di D. rerio dove è precocemente espresso nel sistema nervoso in particolare nella regione ventrale dei primordi ottici. La proteina VSP presenta due domini di legame di tipo PDZ. L’interazione con la proteina Kidins220 avviene tra l’estremità carbossi-terminale (motivo PDZ-binding) di Kidins220 e il dominio PDZ-1 di VSP.
I domini PDZ riconoscono sequenze specifiche di 3-8 amminoacidi situate alle estremità C-terminale dei loro ligandi che, generalmente, terminano con un residuo idrofobico. In particolare, il motivo presente nella Kidins220 contiene una serina in posizione 1670 (che permette di classificarlo come “motivo di classe 1”) e due residui amminoacidici idrofobici in posizione 1671 e 1672 .
Il lavoro di tesi si è articolato su due livelli.
La prima parte è stata finalizzata alla caratterizzazione dei residui amminoacidici di Kidins220 necessari per mediare l’interazione con il PDZ-1 di VSP.
Ho realizzato a questo scopo una proteina ricombinante mutante, priva dei tre amminoacidi C-terminali. Ho quindi verificato la possibilità di interazione tra questo mutante e il dominio PDZ di VSP attraverso esperimenti di cromatografia per affinità (Pull-down).
Il risultato ottenuto ha dimostrato che effettivamente i tre residui sono essenziali per il legame diretto tra il motivo PDZ-binding di Kidins220 e il dominio PDZ-1 di VSP.
Nella seconda parte del lavoro ho proceduto alla caratterizzazione della linea cellulare HN9.10e come sistema modello per effettuare studi funzionali sulla proteina Kidins220.
La linea cellulare HN9.10e deriva dalla fusione somatica di cellule ippocampali di embrione di topo C57BL/6 di 18 giorni e cellule N18TG2 di neuroblastoma murino. In condizioni di coltura opportune queste cellule si differenziano mantenendo le caratteristiche morfologiche e funzionali dei neuroni ippocampali.
Abbiamo quindi usato questa linea cellulare, che esprime endogenamente Kidins220, per effettuare lo studio dell’espressione della proteina chimerica GFP-Kidins220, e del mutante di delezione privo della regione C-terminale GFP-Kidins220.3200.