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Introduzione. In questa tesi sono stati condotti studi sperimentali per valutare l‟effetto citotossico di gemcitabina e sorafenib nei confronti di linee cellulari umane di carcinoma pancreatico e polmonare e per valutare il ruolo dei determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo d'azione di tali chemioterapici.
La gemcitabina (2',2'-difluoro-2'-deossicitidina, dFdC) è un profarmaco e, per esercitare la sua azione citotossica, deve essere fosforilata, dapprima nella 2',2'-difluoro-2'-deossiciditidina monofosfato, poi nella 2',2'-difluoro-2'-deossiciditidina difosfato, che inibisce l‟attività della ribonucleotide reduttasi (RR), e infine nella 2',2'-difluoro-2'-deossiciditidina trifosfato, che compete con la deossicitidina trifosfato per l'incorporazione nel DNA. La prima fosforilazione, essenziale per l'attivazione della gemcitabina, è catalizzata dall'enzima deossicitidina chinasi (dCK).
Il sorafenib (BAY 43-9006) è un composto di recente scoperta, sintetizzato sulla base delle nuove conoscenze riguardanti la struttura cristallina del dominio legante ATP di Raf che appartiene alla categoria delle piccole molecole inibitrici di chinasi. Il suo meccanismo d‟azione coinvolge le vie di trasduzione del segnale più importanti ai fini della crescita, della proliferazione e della sopravvivenza cellulare, mediante l‟inibizione di enzimi chiave ad attività chinasica. Il sorafenib è, infatti, in grado di bloccare C-Raf, wild-type B-Raf e B-Raf mutata, ed ha inoltre mostrato una potente inibizione dei recettori tirosin chinasici coinvolti nella progressione tumorale e nell‟angiogenesi, inclusi il recettore per il fattore di crescita dell‟endotelio vascolare VEGFR2, il recettore- per il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR-) e c-Kit.
Materiali e metodi. Gli studi in vitro sono stati condotti su 8 linee cellulari di carcinoma pancreatico e polmonare, MIA PaCa-2, Capan-1, PANC-1, A549, CALU-1, CALU-6, H23 e
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HCC 827. Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di gemcitabina e sorafenib (0,001-100 M), singolarmente ed in associazione, per tempi di esposizione rispettivamente di 24 ore seguito da 24 ore di wash-out per la gemcitabina e di 72 ore per il sorafenib. L‟effetto citotossico è stato valutato mediante il calcolo della concentrazione inibente il 50% della crescita cellulare (IC50) e l'interazione farmacologica è stata studiata con l‟indice di combinazione (CI). Per valutare eventuali modulazioni del ciclo cellulare, indotte dai farmaci in esame, è stato condotto uno studio citofluorimetrico con una soluzione di ioduro di propidio 25 g/ml. La valutazione dell‟induzione del fenomeno dell‟apoptosi da parte dei due chemioterapici, a concentrazioni pari all‟IC50, è stata effettuata sia con l‟analisi immunoenzimatica dell‟inattivazione della proteina anti-apoptotica Akt, sia con l‟osservazione delle tipiche anomalie morfologiche, mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando come marcatore del DNA nucleare la bisbenzimide. Inoltre, sono stati condotti ulteriori saggi immunoenzimatici per valutare la fosforilazione del recettore tirosin-chinasico c-Kit, della proteina ERK in cellule esposte ai farmaci in studio.
Infine, l‟eventuale modulazione dell‟espressione genica dell‟enzima dCK, delle due subunità della ribonucletide reduttasi (RRM1 e RRM2) e della proteina RKIP in cellule trattate con sorafenib e gemcitabina, a concentrazioni pari all‟IC50, è stata valutata per mezzo della PCR quantitativa utilizzando sonde e primers specifici.
Risultati. La gemcitabina ed il sorafenib hanno determinato un‟inibizione di tipo dose-dipendente della proliferazione cellulare, con valori di IC50 rispettivamente di 0,080,01 M, 0,100,02 M, 0.18±0.04, 1.10±0.01 M,0.39±0.09 M, 0.65±0.08 M, 0.0.10±0.01 M e 0.07±0.01 M per la gemcitabina e 3,480,27M, 0,610,16 M, 4.56±1.32 M, 1.00±0.06 M, 1.2±0.16 M, 2.02±0.10 M, 3.08±0.15 M e 0.46±0.07 M per il sorafenib nelle cellule MIA PaCa-2, Capan-1, PANC-1, A549, CALU-1, CALU-6, H23 e HCC 827 rispettivamente.
I due farmaci in associazione hanno mostrato un effetto citotossico più spiccato e sinergico (CI<1) quando impiegati nella sequenza in cui la gemcitabina precede il sorafenib
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nelle linee pancreatiche Mia Paca-2 e Capan-1 mentre nella linea cellulare PANC-1 si è dimostrata maggiormente citotossica la sequenza inversa. La sequenza gemcitabinasorafenib si è mostrata più citotossica nelle linee polmonari A549 e CALU-1, mentre nelle cellule H23 la sequenza più efficace è stata quella inversa. Nelle cellule CALU-6 e HCC827 le due sequenze si sono mostrate ugualmente sinergistiche.
L‟analisi del ciclo cellulare ha dimostrato che l‟esposizione delle linee cellulari alla gemcitabina determina un incremento della percentuale di cellule in fase S; viceversa, l‟esposizione al sorafenib non ha prodotto un significativa modulazione dopo 72 ore di trattamento. Durante le 72 ore di trattamento con sorafenib e i dati ottenuti mostrano, invece, che nelle cellule pancreatiche Capan-1 e PANC-1 il farmaco determina un aumento della popolazione cellulare in fase G1 dopo 24 ore dal trattamento (+ 16,13 e + 14,50) mentre nella linea MIA PaCa-2 si osserva un arresto in fase G1 dopo 12 ore (+10,04). Nelle cellule polmonari il sorafenib produce un arresto in G1 nelle CALU-1 a 24 ore e a 48 ore nelle altre cellule.
Il trattamento con gemcitabina in tutte le linee cellulari ha causato la riduzione della quantità di Akt fosforilata rispetto all‟Akt totale, favorendo così l‟induzione di apoptosi. Sorafenib, ad una concentrazione pari all‟IC50, è risultato capace modulare il contenuto intracellulare di Akt fosforilata solo in una linea pancreatica PANC-1 (-23,22%). Nelle linee A549, CALU-1 e HCC827, sorafenib induce una riduzione di Akt fosforilata pari a -37.18% e -34.44% mente nelle cellule H23 produce un aumento pari al 31.71%.
L‟esposizione a gemcitabina e sorafenib ha determinato un incremento dell‟indice apoptotico statisticamente significativo rispetto al controllo (7 e 7,3% nelle cellule MIA PaCa-2, 6,5 e 7,2% nelle cellule Capan-1 e 3,3 e 4,3% nelle PANC-1). I risultati ottenuti hanno dimostrato che l‟indice apoptotico prodotto dal trattamento combinato con gemcitabina seguita da sorafenib è superiore a quello registrato per l‟esposizione ai singoli farmaci nelle linee cellulari oggetto d‟analisi (P<0,05). Viceversa, l‟aumento della percentuale di cellule in
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apoptosi dovuto alla combinazione sorafenib→gemcitabina è risultato statisticamente significativo rispetto ai trattamenti singoli solo nella linea cellulare PANC-1 (Figura 5.6).
Nelle cellule polmonari l‟esposizione ai due agenti chemioterapici sia singolarmente che in combinazione ha prodotto un aumento della percentuale di cellule in apoptosi. In particolare la sequenza gemcitabina→sorafenib si è dimostrata la più attiva nelle linee cellulari A549 e CALU-1 (+22.00% e +17.40 % rispettivamente) mentre la sequenza inversa è stata più attiva nelle cellule H23 (+17.13%). Nelle linee CALU-6 e HCC827 le due sequenze sono risultate egualmente efficaci.
L‟analisi della fosforilazione di c-Kit ha evidenziato la capacità del sorafenib di inibire l‟attivazione di questo recettore nelle linee esaminate. L‟analisi dello studio della fosforilazione della proteina ERK ha dimostrato che sorafenib inibisce la fosforilazione di tale proteina in tutte le linee cellulari in studio.
Infine, l‟analisi con PCR quantitativa ha dimostrato che l‟esposizione al sorafenib induce una riduzione statisticamente significativa dell‟espressione genica di RRM1 e RRM2, in tutte le linee cellulari e determina, pertanto, un incremento del rapporto dCK/(RRM1xRRM2). L‟analisi di PCR quantitativa ha permesso di valutare la modulazione dell‟espressione della proteina RKIP nelle cellule trattate con gemcitabina a concentrazioni pari all‟IC50. I dati ottenuti hanno dimostrato la presenza di una modulazione dell‟espressione genica della proteina analizzata ad opera di tale farmaco. In particolare, l'esposizione a gemcitabina ha determinato un aumento statisticamente significativo dell'espressione di RKIP in tutte le linee cellulari in studio (+56.54% nelle MIA PaCa-2, +100.38% nelle Capan-1 e +32.74% nelle PANC-1).
Il trattamento con gemcitabina ha modulato positivamente l‟espressione di RKIP nelle linee cellulari polmonari A549, CALU-6, H23 e HCC827. RKIP non è stato modificato nelle cellule CALU-1 dopo il trattamento con gemcitabina
Conclusioni. I risultati del presente studio permettono di affermare che l‟associazione tra gemcitabina e sorafenib possiede una buona attività antitumorale nelle linee cellulari di tumore
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pancreatico e polmonare, risultante da interazioni favorevoli a livello dell‟induzione dell‟apoptosi, del ciclo cellulare, dell‟inibizione della fosforilazione di enzimi chiave nelle vie di traduzione del segnale e dell‟influenza sull‟espressione di geni coinvolti nel meccanismo d‟azione dei farmaci. Questi dati rappresentano pertanto la base scientifica per lo sviluppo razionale di tale combinazione nell‟ambito di un trattamento chemioterapico delle neoplasie pancreatiche .