• CFAP300
• CRISPR/Cas9
• Discinesia Ciliare Primaria
• Primary Ciliary Dyskinesia
• SPAG1
• Zebrafish

La Discinesia Ciliare Primaria (PCD) è una malattia genetica rara caratterizzata da alterazioni nella struttura e nel movimento delle ciglia cellulari. Le manifestazioni cliniche più ricorrenti sono infezioni del tratto respiratorio, eterotassia associata spesso a malformazioni cardiache e infertilità. Tra i geni implicati in questa patologia rientrano SPAG1 e CFAP300 che codificano per proteine coinvolte nell’assemblaggio delle braccia di dineina. Lo scopo di questo lavoro di tesi è di utilizzare il teleosteo zebrafish come modello animale per lo studio di questa patologia. Sono stati utilizzati due approcci: la creazione e caratterizzazione di mutanti per i geni ortologhi in zebrafish di SPAG1 e CFAP300 utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, e un approccio di base editing. Gli embrioni mosaico mutanti per i suddetti geni presentano un aumento significativo dell’angolo di looping cardiaco e casi di situs inversus o di mancanza di looping. Una diminuzione della frequenza del battito delle ciglia del bulbo olfattivo si osserva solo negli embrioni microiniettati con il complesso CRISPR/Cas9 per spag1a.
Parallelamente sono stati collezionati dei dati sperimentali preliminari per un futuro utilizzo del base editor zAncBE4max per la creazione di modelli di medicina personalizzata. I dati raccolti risultano essere promettenti per una futura applicazione di questo sistema per la creazione di modelli malattia che presentano la stessa mutazione in cfap300 che caratterizza due pazienti affette da Discinesia Ciliare Primaria.

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a rare genetic disorder characterized by alterations in the structure and movement of cellular cilia. The most recurrent symptoms are infections of the respiratory tract, heterotaxia often associated with cardiac malformations and infertility. Among the genes implicated in this disease there are SPAG1 and CFAP300 which encode for proteins essential for assembly of dynein arms. The aim of this thesis work is to exploit the teleost zebrafish as an animal model for studying this pathology. Two different approaches will be used: the creation and characterization of zebrafish mutants for the orthologous genes of SPAG1 and CFAP300 using the CRISPR/Cas9 system, and a base editing-based approach. The mosaic mutant embryos for all genes show a significant increase in the cardiac looping angle as well as cases of situs inversus and absence of cardiac looping. A decrease in the cilia beating frequency in the olfactory pit has been observed only in embryos microinjected with the CRISPR/Cas9 complex for spag1a.
At the same time, preliminary experimental data were collected for a future use of the base editor zAncBE4max for the creation of personalized medicine models. The data collected are promising for a future application of this system for the creation of disease models that present the same mutation in cfap300 that characterizes two patients with PCD, creating an experimental tool to identify novel therapeutic approaches for this disease.