• Context variables
• Liposomes
• Temperature

Nella biologia sintetica contemporanea l’approccio considerato più facilmente percorribile è quello semi-sintetico, che consente di generare liposomi funzionalizzati, ovvero contenenti al loro interno reti biochimiche moderatamente complesse comprendenti metaboliti, proteine (enzimi), acidi nucleici e altre strutture sovramolecolari (ribosomi, ecc.). Tali liposomi sono ottimi surrogati di cellule vere e vengono chiamati semi-synthetic minimal cells (SSMC): la loro stabilità e versatilità nella composizione li rendono candidati idonei a implementare un amplissimo ventaglio di applicazioni: da processi industriali alla biomedicina.
I numerosi progressi compiuti in questo campo negli ultimi anni hanno reso impellente l’esigenza di definire un protocollo per una progettazione razionale delle SSMC: le possibilità di sintesi, infatti, sono virtualmente infinite, ma solo poche risultano funzionali nella pratica. Occorre, infatti, che i vari pathway metabolici ospitati nella SSMC riescano a funzionare in modo armonico e bilanciato. Per ottenere un tale equilibrio come risultato di prove per tentativi occorre preventivare molti fallimenti, lungo tempo e alta spesa: una progettazione computazionale che, attraverso uno screening teorico, permetta di individuare i candidati più idonei a risultare stabili ed efficienti, è l’unica strada per avere una sintesi efficiente di SSMC. La soluzione più naturale è di costruire modelli teorici delle reti biochimiche ospitate nelle SSMC impiegando i vari simulatori sviluppati nelle ricerche di Systems Biology. Questo approccio però risulta difettivo: è infatti pratica comune della Systems Biology descrivere le reti metaboliche tralasciando di trattare esplicitamente le condizioni ambientali in cui il sistema si trova: variabili come pH, temperatura, forza ionica, ecc., non vengono prese in considerazione perché possono essere considerate costanti in quasi tutti i casi relativi a organismi biologici. Questa semplificazione non vale però per le SSMC, dove non sono naturalmente presenti meccanismi di buffering o controllo. Per modellare accuratamente le SSMC, quindi, occorre dare una trattazione esplicita dell’influenza delle variabili ambientali.
In questa tesi viene indagata sperimentalmente l’influenza della più basilare e meglio controllabile variabile ambientale: la temperatura, misurando come un sistema biochimico intrappolato in SSMC reagisce al variare della stessa, anche in dipendenza della composizione della membrana della SSMC, che costituisce una variabile ambientale imprescindibile per un sistema intrappolato in un liposoma. I dati sperimentali sono stati poi interpretati per fornire agli sviluppatori di simulatori biochimici delle linee guida basilari per tener conto delle variabili ambientali nei modelli.
Il caso di studio prescelto concerne l’attività esterasica dell’Anidrasi Carbonica (CA) sulla Fluoresceina diacetato, che viene convertita in un substrato fluorescente, la Fluoresceina.
Sono stati usate due classi di liposomi che si differenziano per le loro dimensioni (200nm, 1-20µm) e due composizioni di membrana per entrambe le classi, per evidenziare come anche questa variabile del contesto biologico aggiunga un grado di complessità alla descrizione dell’intero sistema.
La cinetica dell’enzima incapsulato nei liposomi è stata registrata per mezzo di analisi fluorimetriche a diverse temperature permettendoci di ottenere informazioni sul comportamento medio dell’intera popolazione. In seguito sono state svolte analisi di microscopia confocale sui liposomi di dimensioni maggiori per studiare una possibile dipendenza dal raggio della cinetica e avere una risoluzione sul singolo liposoma.
I dati ricavati sperimentalmente sono poi stati confrontati con quelli ottenuti in silico dove è stata simulata la reazione studiata negli esperimenti sui liposomi di dimensioni maggiori (1-20µm). Con l’approccio sperimentale e teorico abbiamo dunque evidenziato come il sistema sia dipendente da tre parametri: temperatura, composizione di membrana e dimensioni del liposoma. La tesi descrive come il simulatore dovrebbe tener conto di questi parametri in modo esplicito.