• gene reversion
• Cell cycle
• BRCA1
• yeast

Il laboratorio presso cui svolgo la tesi si occupa da diversi anni dello studio della proteina oncosoppressore BRCA1 e della classificazione delle sue varianti missenso tramite analisi e saggi funzionali in S. cerevisiae. Il mio lavoro di tesi si inserisce in un progetto più ampio che prevede la caratterizzazione delle funzioni e dei meccanismi molecolari con cui agisce BRCA1 durante le diverse fasi del ciclo cellulare e la comprensione dei meccanismi attraverso i quali le varianti missenso patogenetiche di BRCA1 contribuiscono alla tumorigenesi. È noto che BRCA1 possiede un ruolo attivo nel meccanismo di riparazione del DNA per ricombinazione omologa (HRR) ed è stato dimostrato anche un coinvolgimento della proteina, seppure indiretto, in altri sistemi di riparazione del DNA, quali Non-Homologous End-Joining (NHEJ), Base Excision Repair, Mismatch Repair. Inoltre BRCA1 svolge un ruolo in quella che è la scelta del pathway di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA. Questa scelta è strettamente correlata con il ciclo cellulare. Nelle fasi S/G2, BRCA1 inibisce la NHEJ favorendo la HRR che, utilizzando il cromatidio fratello come stampo, costituisce un sistema error-free, mentre nelle fasi G0/G1 BRCA1 promuove la NHEJ, sfavorendo l'HRR che, in assenza di un cromatidio fratello utilizzerebbe come stampo il cromosoma omologo portando a perdita di eterozigosità. Lo scopo del mio lavoro di tesi è capire se le varianti BRCA1 patogenetiche espresse in cellule arrestate nelle varie fasi del ciclo cellulare hanno un effetto sulla reversione genica diverso dalle varianti neutre: questo potrebbe dare delle informazioni sul meccanismo di cancerogenesi dovuto a BRCA1. Nel mio lavoro, varianti di BRCA1 patogenetiche e neutre sono state espresse nel ceppo aploide RSY6 di S. cerevisiae che contiene nel suo genotipo l'allele ilv1-92, una mutazione puntiforme del gene che codifica per la treonina deaminasi che rende le cellule incapaci di crescere in terreno privo di isoleucina. Eventi di reversione portano al recupero della capacità di crescere in assenza di isoleucina; in teoria, tali eventi possono avvenire sia tramite reversione genica vera sia tramite soppressione intra o extra-genica. Per l'espressione di BRCA1 è stato utilizzato il vettore centromerico YCp50 che contiene un promotore inducibile dal galattosio. Gli esperimenti sono stati effettuati come segue: le cellule trasformate con le varianti di BRCA1 sono state inoculate e mantenute in crescita in terreno selettivo fino a metà della fase logaritmica (tra 1 e 5 x 107 cells/mL), lo stesso inoculo e' stato suddiviso in tre parti per il blocco nelle fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare; nelle cellule bloccate e' stata indotta l'espressione di BRCA1e dopo circa 20h dall'induzione le cellule sono state piastrate su terreno completo e su terreno privo di isoleucina; la frequenza di mutazione è data dal rapporto tra il numero di colonie cresciute sui due tipi di terreno. Le condizioni applicate per arrestare le cellule nelle fasi G1, S e G2 sono, rispettivamente, crescita in terreno minimo, trattamento con idrossiurea 100mM (inibitore della ribonucleotide reduttasi) e trattamento con nocodazolo 15μg/ml (inibitore della polimerizzazione dei microtubuli). L'efficacia dei metodi applicati per ottenere il blocco del ciclo cellulare è stata verificata tramite analisi al microscopio e analisi al citofluorimetro dopo 3h e dopo 24h dal trattamento. Per caratterizzare gli eventi di reversione è stato sequenziato il gene ILV1 dopo amplificazione da DNA genomico estratto da 24 cloni revertanti. Per caratterizzare l'espressione e il livello di proteina di BRCA1 nelle diverse fasi del ciclo cellulare sono state eseguite analisi di real-time PCR e di Western Blot. Nel gene ILV1 sequenziato risulta presente la stessa mutazione puntiforme caratteristica dell'allele ilv1-92, indicando che si è verificato un evento di soppressione extragenica. Il livello di proteina BRCA1 ottenuto tramite Western Blot sembra più basso in fase G1, rispetto alle fasi S e G2. L’espressione della proteina BRCA1 wild-type non induce alcun effetto sulla reversione in cellule in G1, S e G2, mentre tutte le varianti patogenetiche analizzate e una neutra determinano un aumento della frequenza di reversione rispetto alla proteina wild-type almeno in una fase del ciclo cellulare. Inoltre sono in corso esperimenti atti a valutare l'effetto di BRCA1 sulla reversione genica in cellule di lievito trattate con bleomicina ed esperimenti di immunoprecipitazione per verificare se vi sia interazione tra BRCA1 e le proteine di lievito omologhe agli interattori proteici noti di BRCA1.
Questo tipo di studio è stato intrapreso con l'obiettivo di caratterizzare l'espressione e l'azione della proteina umana BRCA1 in dipendenza delle fasi del ciclo cellulare nel lievito e di ricercare una eventuale correlazione tra il tipo di variante missenso espressa e il fenotipo osservato. Un cambiamento della frequenza di mutazione in una determinata fase del ciclo cellulare in seguito all'espressione di una variante missenso può indicare il coinvolgimento di uno specifico dominio della proteina nella funzione normalmente svolta in quella fase del ciclo cellulare, nonché suggerire un possibile meccanismo tumorigenico della variante.