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Tesi etd-10062014-102456


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
PETROTTO, EDOARDO
URN
etd-10062014-102456
Title
Studio del meccanismo di apoptosi indotto dal trattramento con deossicoformicina e deossiadenosina in cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Supervisors
relatore Dott.ssa Garcia Gil, Maria De Las Mercedes
relatore Prof.ssa Camici, Marcella
Parole chiave
  • caspasi
  • apoptosi
  • ADA-SCID
  • SH-SY5Y
  • neuroblastoma
Data inizio appello
20/10/2014;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
Il dismetabolismo delle purine è frequentemente associato a disfunzioni psicomotorie, ma il legame molecolare tra lo squilibrio metabolico e le manifestazioni neurologiche, nella maggior parte dei casi, è ancora poco chiaro. La deficienza di adenosina deaminasi (ADA), enzima che catalizza la deaminazione dell’adenosina e della deossiadenosina, è associata ad una grave immunodeficienza e ad alterazioni nel funzionamento di molti organi come osso, fegato, reni e sistema nervoso. I disturbi neurologici includono disordini nella coordinazione motoria, disabilità nell’apprendimento, iperattività, epilessia e deficit uditivi. Il trapianto di midollo osseo è in grado di risolvere i problemi del sistema immunitario ma non quelli neurologici. Per lo studio dei possibili meccanismi alla base delle manifestazioni neurologiche associate alla deficienza di ADA è stato utilizzato un modello di cellule neuronali, la linea SH-SY5Y, derivata da un neuroblastoma umano, trattate con un inibitore di questo enzima, la deossicoformicina (dCF), e l’aggiunta di deossiadenosina (dAdo), che si accumula in assenza della suddetta attività enzimatica.
E' stato indagato l'effetto di questo trattamento sulla vitalità cellulare, sui livelli di ATP e dATP e su l'attività delle caspasi iniziatrici -8 e -9 ed effettrici (caspasi-3) e l'effetto sia di antiossidanti che di molecole che alterano i livelli di calcio intracellulare. I risultati indicano che l'inibizione di ADA e l'accumulo di dAdo diminuiscono la vitalità nel modello utilizzato. Nifedipina, rianodina, BAPTA-AM, EDTA, N-acetilcisteina, melatonina, acido nordiidroguaiaretico e baicaleina non determinano un effetto protettivo sulla vitalità nelle cellule trattate. La 5'-ammino-5'-deossiadenosina, un inbitore della dAdo chinasi, aumenta significativamente la vitalità cellulare, sebbene dopo 15 e 24 ore di trattamento non si sia osservato un aumento di dATP. Le caspasi -9 e -8 si attivano, rispettivamente, dopo 6 e 8 ore di trattamento, mentre la caspasi-3 mostra una fase precoce e una più tardiva di attivazione. Se le condizioni sperimentali rispecchiano la deficienza di ADA, è possibile ipotizzare che l'effetto nocivo sui neuroni descritto in questa tesi abbia un ruolo nel malfunzionamento di alcuni circuiti neuronali nei pazienti ADA-SCID.

The purine metabolic disorders are frequently associated with psychomotor disturbances, but the molecular link between the metabolic imbalance and the neurological manifestations, in most cases, is still unclear. The deficiency of adenosine deaminase (ADA), the enzyme which catalyzes the deamination of adenosine and deoxyadenosine, is associated with a severe immunodeficiency and to abnormalities in functioning of many organs such as bone, liver, kidney and nervous system. Neurological disorders include disturbances in motor coordination, learning disabilities, hyperactivity, epilepsy and hearing impairment. The transplantation of bone marrow is able to solve the problems of the immune system but not the neurological ones. For the study of the possible mechanisms underlying the neurological manifestations associated with deficiency of ADA, a model of neuron, the SH-SY5Y line, derived from a human neuroblastoma was used. Cells were treated with an inhibitor of ADA, deoxycoformycin (dCF) and the addition of deoxyadenosine (dAdo), which is known to accumulate intracellulary in the absence of the aforementioned enzymatic activity.
It has been studied the effect of this treatment on cellular viability, on ATP and dATP levels and on the activity of initiator caspases -9 and -8 and effector (caspase-3), and the effect either of antioxidants or molecules altering intracellular calcium levels. The results indicate that ADA inhibition and dAdo accumulation decrease viability in this model. Nifedipine, ryanodine, BAPTA-AM, EDTA, N-acetylcysteine, melatonin, baicalein and nordihydroguaiaretic acid do not determine a protective effect on viability of treated cells. 5'-ammino-5'-deoxyadenosine, a dAdo kinase inhibitor, significantly increases cell viability although it has not been observed an increase in dATP following 15 or 24 hours of treatment. Caspase-9 and 8 are activated after 6 h and 8 h of treatment respectively, while caspase-3 shows both an early and a late phase of activation. If these experimental conditions mirror ADA deficiency, it is possible to hypothesize a role of the noxius effect on neurons described in the present Thesis on the malfunctioning of some neuronal circuits in ADA-SCID patients.
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