• ciliati
• microbioma
• procarioti
• protisti

In natura, esistono innumerevoli esempi di simbiosi tra organismi animali, vegetali e microrganismi, e, nonostante i numerosissimi studi a riguardo, molte associazioni non sono ancora state scoperte. In particolare, in questo lavoro, sono state prese in esame le associazioni simbiotiche tra ciliati e procarioti. Le tecniche principali per lo studio di queste associazioni simbiotiche in ambiente sono il Full Cycle rRNA Approach e la Fluorescent In Situ Hybridization. In entrambi i casi la messa in coltura del ciliato d’interesse risulta un fattore cruciale per la riuscita. Da alcuni anni a questa parte ha acquisito sempre più importanza il concetto di microbioma, e, grazie a nuovi sistemi di sequenziamento, come il Next Generation Sequencing, è stato possibile ampliare enormemente le conoscenze in questo ambito. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di mettere a punto e testare un nuovo protocollo per la caratterizzazione delle associazioni tra protisti e procarioti, da singola cellula e utilizzando il sequenziamento NGS. La fase iniziale di questo studio è stata incentrata sulla messa a punto del protocollo per individuare le condizioni ottimali di conservazione e amplificazione. Le singole cellule di ciliati, isolate da colture già presenti in laboratorio, sono state sottoposte a lavaggi e conservate in etanolo al 70%. Le prove effettuate hanno mostrato che erano necessari due passaggi successivi di amplificazione per ottenere la concentrazione ottimale di DNA amplificato: uno per amplificare simultaneamente l'intera sequenza dei marcatori eucariotici e procariotici (geni codificanti per il Small SubUnit, SSU, rRNA), e un altro consistente in una nested PCR con primer per regioni interne dei due geni (quello eucariotico e quello procariotico) dotati di adattatori per il sequenziamento Illumina. I risultati ottenuti con il test pilota hanno mostrato l’efficacia del nuovo protocollo nel riconoscimento del ciliato ospite, nel riconoscimento dei simbionti conosciuti e nell’applicabilità su cellule di diverse dimensioni. Nonostante i risultati appena citati si è resa necessaria un’ulteriore modifica che prevedeva la separazione dell’amplificazione del marcatore eucariotico e procariotico nel secondo passaggio di PCR, con il fine di evitare che vi fosse una sovra-rappresentazione del marcatore eucariotico. Il protocollo modificato è stato quindi validato su campioni ambientali prelevati in pozze costiere dulciacquicole (foce del fiume Serchio, Pisa) e marine (Livorno). Da ogni campione sono state prelevate tre aliquote dalle quali sono state raccolte le singole cellule di ciliato appartenenti ai diversi morfotipi presenti e sono state stoccate come indicato precedentemente. Con l’aliquota rimanente di ciascun campione si è deciso di effettuare un’estrazione di DNA totale e, a seguire, una PCR con primer per il gene del 16S rRNA dotati di adattatori per il sequenziamento NGS. Tali campioni sono stati utilizzati come controlli. Le singole cellule sono state trattate secondo il protocollo modificato e gli amplificati sono stati inviati per il sequenziamento NGS. I reads sono stati analizzati con il programma QIIME, grazie al quale è stato possibile ottenere indicazioni sulle abbondanze relative dei taxa che componevano i microbiomi presenti nelle cellule, e le comunità microbiche presenti nei campioni. È risultato subito evidente il maggior numero di taxa presenti nei controlli, rispetto alle singole cellule (in media un rapporto di circa 6:1). Con il programma PAST sono state effettuate analisi statistiche utilizzando il non-metric Multi Dimensional Scaling, il quale ha evidenziato la netta distanza tra i gruppi dei microbiomi presenti nelle singole cellule e le comunità microbiche dei rispettivi controlli, indice di una probabile selettività dei ciliati nella composizione dei loro microbiomi. Gli indici di diversità di Shannon, Simpson e Evenness hanno confermato le indicazioni ottenute con l’nmMDS. Per ogni analisi è stata valutata la significatività statistica con il test ANOSIM. Si è poi valutato se il protocollo messo a punto potesse dare indicazioni sulla presenza di simbionti procariotici stabili nei ciliati. È stata valutata l’abbondanza relativa di due simbionti obbligati conosciuti: il Polynucleobacter necessarius, simbionte di diverse specie di Euplotes, e archea dell’ordine Methanomicrobiales, simbionti di ciliati anaerobi. Il P. necessarius è stato rilevato in tre dei quattro Euplotes isolati, mentre gli archea metanogeni in uno dei tre ciliati anaerobi. Prendendo in esame i batteri obbligati del genere Rickettsiales, conosciuti come simbionti di ciliati, sono state ricavate interessanti informazione circa la presenza di questi batteri in cellule mai studiate per le simbiosi, a causa della difficile coltivabilità di molti ciliati. In particolare, il caso che ha suscitato maggiore interesse è stato quello riguardante i batteri dell’ordine Rickettiales trovati in un Trithigmostoma sp.; in precedenti studi, tramite fotografie al TEM, era stata riscontrata la presenza di numerosi batteri simbionti, sulla cui identità non si aveva nessuna informazione. L’alta percentuale di contigs di Rickettsiales riscontrata nel microbioma della cellula di Trithigmostoma sp. fa supporre che i simbionti stabili fossero proprio batteri dell’ordine Rickettsiales. Un obiettivo di questo lavoro era quello di valutare l’efficacia del metodo nel dare indicazioni di simbiosi stabili in ciliati di cui si avevano già riscontri dalla letteratura, oltre a esaminare i microbiomi di ciliati mai utilizzati per questo tipo di studi, al fine di individuare nuove possibili associazioni stabili. I risultati hanno dimostrato che, grazie all’utilizzo diretto delle singole cellule di ciliati, è stato possibile lavorare con specie fino ad ora mai utilizzate a causa della non coltivabilità di gran parte di esse, e di ottenere informazioni su potenziali associazioni simbiotiche non ancora prese in esame. Il nuovo approccio è stato inoltre testato e validato in ambienti diversi, sia in ambiente dulciacquicolo che marino, manifestando così la sua versatilità ed efficacia.