• canali meccanosensibili
• cono di crescita
• Hirudo medicinalis
• SICM

Il microscopio a scansione di conduttanza ionica (SICM per Scanning Ion Conductance Microscope) è un dispositivo a sonda in grado di produrre immagini tridimensionali di cellule viventi, adese ad un substrato e immerse in una soluzione fisiologica. Il principio di funzionamento, introdotto da Hansma e coll. nel 1989, è stato perfezionato nell’ultima decade, fino a generare un promettente strumento di indagine biologica.
La sonda è costituita da una pipetta di vetro che, controllata da tre attuatori piezoelettrici con risoluzione nanometrica, esegue la scansione di un’area prescelta del preparato, percorrendo un corrispondente reticolo XY. Per ogni punto del reticolo la pipetta viene spostata lungo l’asse Z, verso la superficie non conduttiva del preparato. Attraverso la punta della sonda viene prodotta una corrente ionica, la cui ampiezza dipende dalla distanza punta-preparato. Un sistema di controllo a feedback ferma la discesa della sonda ad una distanza prefissata dal preparato. Si ricava così una matrice di quote che vengono utilizzate per ricostruire un’immagine tridimensionale dell’area studiata.
Questa tesi sperimentale descrive la costruzione di un SICM e la sua applicazione alla ricostruzione submicrometrica tridimensionale di alcune regioni cellulari dotate di alta motilità.
Questo particolare microscopio è stato montato sul tavolino traslatore di un microscopio Nikon Diaphot 300 provvisto di ottiche in contrasto di fase ed in contrasto interferenziale. Le modalità di funzionamento sono state ottimizzate per registrare in parallelo serie temporali di immagini dello stesso preparato, sia ottiche che di scansione.
Le applicazioni di questa tecnica sono state fatte inizialmente su cellule CHO (chinese hamster ovary) transfettate per esprimere un recettore per il TSH e successivamente su singole cellule nervose di Hirudo medicinalis isolate in coltura.
Nelle cellule CHO sono state studiate:
1) mappe topografiche di cellule intere;
2) tipiche variazioni di forma e di volume indotte dalla stimolazione della adenilato ciclasi, sia diretta che tramite attivazione del recettore per il TSH;
3) la motilità dei margini cellulari.
I risultati ottenuti dimostrano che il SICM è in grado di produrre misure ad alta risoluzione spaziale delle variazioni di forma e di volume di singole cellule in risposta a stimoli fisiologici.
Il vantaggio dell’acquisizione della terza dimensione nelle immagini di regioni dinamiche delle cellule è ben dimostrato da scansioni in time-lapse di neuriti in crescita. Sono state ottenute rappresentazioni 3D di coni di crescita neuronali che sono tra le prime prodotte in assenza di fissazione e senza contatto tra sonda e preparato. Utilizzando immagini di questo tipo è possibile misurare i cambi di volume e di area di regioni diverse del cono (ad esempio delle zone C e P), sia in condizioni basali che in presenza di sostanze che interferiscono con la crescita neuritica.