• mir-204
• melanoma
• lna-204
• Efna1
• apoptosis

Come è stato dimostrato sperimentalmente in vari modelli animali, i miRNA (piccole molecole di RNA endogeno non codificante con funzione regolatrice) svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo e nella progressione del tumore. In particolare, questo studio è focalizzato sul miR-204 che, nelle cellule di melanoma, è modulato negativamente da BRAFV600E attraverso la via ERK. Sebbene appartenga alla stessa famiglia di miR-211, il miR-204 esercita ruoli biologici diversi e correlati al livello di espressione. Infatti, se sovraespresso, svolge una funzione oncosoppressiva e, attraverso l'inibizione del gene AP1S2, provoca una riduzione della capacità migratoria / invasiva delle cellule. Al contrario, inibendolo attraverso l'uso di LNA-204, è stato osservato un aumento dell'apoptosi, sia nelle cellule in coltura che nei modelli in vivo. Sulla base di questa osservazione, è stato ipotizzato che il miR-204 sia essenziale per la sopravvivenza delle cellule di melanoma e che la sua inibizione possa essere sfruttata per sviluppare una possibile strategia terapeutica antitumorale.
Nel mio lavoro di tesi, utilizzando la linea di melanoma A375-miR-204-sgRNA, in cui la quantità di miRNA endogeno è stata ridotta mediante la tecnica del CRISPR-Cas9 rispetto alla linea di controllo (A375-AVV1-sgRNA), ho dimostrato che l’inibizione del miR- 204 induce l'apoptosi in maniera dose-dipendente. Ho anche studiato i diversi pathway apoptotici, per capire quale di essi media l'apoptosi osservata. Attraverso il saggio delle caspasi ho misurato il livello di espressione di Caspase-8, Caspase-9 e Caspase 3/7 a 9-16-24 h. I dati ottenuti suggeriscono che non esiste una via prevalente, ma entrambe si attivano.
Infine, per identificare almeno un target diretto del miR-204, ho utilizzato quattro diverse strategie che mi hanno permesso di ottenere un elenco di target candidati. Per la validazione di ciascuno di questi, ho utilizzato due metodiche sequenziali: 1) validazione per qRT-PCR mediante un time-course (9-16-24 h) per valutare il livello di espressione del gene a ciascun tempo; 2) l'esperimento di rescue mediante saggio di vitalità o annessina (cotrasfezione dell'LNA-204 insieme all' siRNA del candidato bersaglio). Per la maggior parte dei candidati analizzati non ho ottenuto un rescue statisticamente significativo. L'unico gene per il quale ho ottenuto risultati promettenti è l'EFNA1, che codifica per il ligando di un recettore specifico per le efrine. Sulla base dei dati fin qui riportati, il lavoro procederà con l'analisi e la caratterizzazione dei restanti target candidati e con lo studio di EFNA1 per dimostrare che è un bersaglio diretto del miR-204 e per confermare il suo ruolo proapoptotico sia in vitro che in vivo.

As experimentally demonstrated in various animal models, miRNAs (small molecules of non-coding endogenous RNA with regulatory function) play a crucial role in tumor development and progression. In particular, my study is focused on miR-204 which, in melanoma cells, is negatively modulated by BRAFV600E through the ERK pathway.
Although it belongs to the same family as miR-211, miR-204 exerts different biological roles depending on its expression level. In fact, if over-expressed, it exerts an oncosuppressive function and, through the inhibition of AP1S2 gene, it causes a reduction in cells migratory/invasive capacity. On the contrary, by inhibiting it through the use of LNA-204, an increase in apoptosis was observed, both in cultured cells and in vivo models. Based on this observation, we have hypothesized that miR-204 is essential for melanoma cells survival and that its inhibition can be exploited to develop a possible antitumor therapeutic strategy.
In my thesis work, using the A375-miR-204-sgRNA melanoma line, in which the amount of endogenous miRNA was reduced by the CRISPR-Cas9 technique compared to the control line (A375-AVV1-sgRNA), I demonstrated that miR-204 inhibition induces apoptosis in a dose-dependent manner. I also investigated the different apoptotic pathways, to understand which of them mediates the observed apoptosis. Through caspase assay, I measured the expression level of Caspase-8, Caspase-9 and Caspase 3/7 at 9-16-24 h. The obtained data suggest that there isn’t a predominant pathway, but both the extrinsic and the intrinsic pathway are activated.
Finally, in order to identify at least one miR-204 direct target, I used four different strategies that allowed me to obtain a list of candidate targets. For the validation of each of these, I used two sequential methods: 1) validation for qRT-PCR by means of a time-course (9-16-24 h) to evaluate the level of gene expression at each time point; 2) rescue experiment through viability assay or annexin assay (by cotransfecting the LNA-204 together with the siRNA of the target candidate). For most of the analyzed candidates I have not obtained a statistically significant rescue rate. The only gene for which I have obtained promising results is EFNA1, which encodes the ligand of an ephrin receptor. Based on the data reported so far, the work will proceed with the analysis and characterization of the remaining candidate targets and with the study of EFNA1, to demonstrate that it is a direct target of miR-204 and to confirm its proapoptotic role both in vitro and in vivo.