• SIRT 1
• obesità
• diabete
• AMPK

INTRODUZIONE: L’obesità è una condizione caratterizzata da un accumulo eccessivo o anormale di grasso nel tessuto adiposo che può influire negativamente sullo stato di salute.
Ad oggi, l’obesità rappresenta uno dei principali problemi di salute pubblica a livello mondiale, di carattere epidemico, sia perché la sua prevalenza è in costante e preoccupante aumento, non solo nei Paesi occidentali ma anche in quelli a basso-medio reddito, sia perché è un importante fattore di rischio per varie malattie croniche, quali diabete mellito di tipo 2, malattie cardiovascolari e tumori, causando un incremento della morbilità e della mortalità nei pazienti che ne sono affetti. Molti studi evidenziano infatti come la principale complicanza endocrino-patologica dell'obesità sia proprio il diabete di tipo 2. L'associazione obesità-diabete di tipo 2 è molto stretta, tanto che l'80% dei casi di diabete di tipo 2 possono essere ricondotti ad obesità.
In aggiunta, il rischio di diabete aumenta linearmente con l'aumento dell'indice della massa corporea (BMI) e con il crescere della massa grassa addominale, mentre all'opposto perdita di peso ed esercizio fisico diminuiscono la resistenza insulinica e riducono il rischio di insorgenza di diabete di tipo 2.
Proprio per le dimensioni che stanno raggiungendo, il mondo della ricerca si sta sempre più concentrando sullo studio di questi disordini (obesità e diabete) e soprattutto su eventuali nuovi target farmacologici a scopo non solo curativo ma anche preventivo.
A questo proposito la letteratura evidenzia come SIRT 1 potrebbe essere una proteina chiave in questo contesto. Infatti, i livelli di SIRT 1 diminuiscono durante il processo di aging, nell’obesità e nei fenomeni di insulino-resistenza, per cui il mantenimento di adeguati livelli di questa proteina nelle sedi di interesse (ipotalamo, fegato e tessuto adiposo) potrebbe essere fondamentale proprio per prevenire un aumento del peso corporeo legato all’invecchiamento o allo sviluppo di resistenza alla leptina o all’insulina, associata a sua volta all’obesità e al diabete.
SCOPO: Sulla base di queste premesse numerosi studi hanno posto al centro dell’attenzione SIRT 1 come target terapeutico nella gestione delle malattie metaboliche attraverso un'intensa ricerca di meccanismi o sostanze in grado di potenziarne l’attivazione. A tal proposito, lo scopo di questa tesi sperimentale è proprio quello di valutare l’effetto di sostanze naturali e non tossiche, potenzialmente attivanti SIRT 1, sia in modelli in vitro che in modelli murini di diabete di tipo 2. In particolare, verrà verificato se le sostanze sono in grado di modulare l’espressione e/o l’attivazione di proteine target come SIRT 1 e AMPK cruciali nei processi metabolici e, soprattutto, nell’obesità e nel diabete mellito di tipo 2.
MATERIALI E METODI: Lo studio in vitro, ha previsto l’utilizzo di cellule INS-1E, ottenute mediante isolamento di cellule clonali dalle parentali INS-1 derivanti da insulinoma di ratto, indotto da irraggiamento con raggi X (Skelin et al. 2010). Le cellule INS-1E risultano possedere capacità fondamentali per l’utilizzo in vitro quali il mantenimento di un fenotipo stabilmente differenziato e la capacità di secernere insulina in risposta ad elevate concentrazioni di glucosio (Asfari et al. 1992). Le sostanze utilizzate per i trattamenti sono state l’Acido Ferulico (25-50 μM) e il Tirosolo (10-20 μM). Prima dei trattamenti, sia nella prima fase che nella seconda fase dell’esperimento, le cellule sono state pre-incubate con glucosio a due diverse concentrazioni (5.5mM e 30mM) per 48 ore e successivamente trattate con le sostanze in esame, sia singolarmente che in associazione per un tempo di incubazione di 24 ore. Nella prima fase dell’esperimento, per ciascuna di queste sostanze è stata testata la loro eventuale citotossicità a diverse concentrazioni utilizzando il metodo fluorimetrico CellTiter-Blue cell viability assay (Promega). Nella seconda fase dell’esperimento, invece, è stato valutato l’effetto di Acido ferulico e Tirosolo sull’espressione di SIRT 1 e sull’attivazione di AMPK mediante tecnica del Western Blot, mentre i livelli di insulina sono stati quantificati mediante Test Elisa.
Per quanto riguarda invece lo studio pilota in vivo, questo è stato condotto su 36 ratti Wistar maschi sani. Dopo la settimana di acclimatazione gli animali sono stati poi casualmente suddivisi in 6 gruppi e opportunamente trattati con l’Acido Ferulico (25-50 mg/kg) e il Tirosolo (20 mg/kg), in seguito a somministrazione singola o associata, per 8 settimane. Al termine dei trattamenti gli animali sono stati anestetizzati con iniezione intraperitoneale di Fenobarbital sodico (60mg/kg) e sottoposti a prelievo di sangue dall’aorta addominale, con apposita siringa con eparina. Gli animali sono stati poi successivamente sacrificati per overdose da anestetico.
Dopo la puntura cardiaca sono stati rimossi i tessuti di interesse (fegato, tessuto adiposo, cuore e rene), opportunamente processati per le successive valutazioni sperimentali. I campioni di plasma sono stati utilizzati per la quantificazione di SIRT 1 mediante apposito kit ELISA (Rat Sirtuin 1 (SIRT1) ELISA Kit- MyBioSource, San Diego, California, USA), mentre i campioni di tessuto sono stati utilizzati per la valutazione dell’espressione/attivazione di SIRT 1 e AMPK mediante Western Blot.
RISULTATI: STUDIO IN VITRO - L’analisi dei dati ottenuti dai test di citotossicità ha messo in evidenza come non vi sia nessuna variazione significativa del numero di cellule vitali dei campioni trattati con Acido Ferulico e Tirosolo, rispetto al controllo, sia in condizioni basali di glucosio (5.5 mM) sia in condizioni di elevati livelli di glucosio (30 mM), dimostrando in questo modo la non tossicità delle sostanze in esame. Inoltre, i risultati ottenuti mediante Western Blot evidenziano come l’espressione/attivazione di SIRT 1 e di AMPK sia significativamente aumentata in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo di controllo, quando le cellule sono state trattate con le singole sostanze e in associazione (***p<0.001) sia in condizioni basali di glucosio sia in condizioni di elevati livelli di glucosio.
In dettaglio, l’analisi dei risultati delle associazioni tra le sostanze (Acido Ferulico+Tirosolo) ha messo in evidenza come la loro somministrazione associata comporti un aumento dell’espressione/attivazione di SIRT1 e di AMPK maggiore e statisticamente significativo rispetto a quello ottenuto sommando gli effetti delle singole somministrazioni, evidenziando quindi la presenza di un effetto sinergico tra le sostanze sull’espressione/attivazione di SIRT1 e di AMPK, sia in condizioni basali di glucosio (5.5mM Glu) per SIRT 1 e AMPK (#p<0.05), sia in condizioni di elevati livelli di glucosio (30 mM) solo per SIRT 1 (#p<0.05); mentre non si osservava un’azione sinergica delle sostanze sull’attivazione di AMPK in condizioni di 30 mM di glucosio (p=N.S).
Infine, la valutazione dei livelli di insulina mediante Test Elisa ha messo in evidenza come il Tirosolo e l’Acido Ferulico, somministrati sia singolarmente che in associazione, sono stati in grado di stimolare un aumento del rilascio di insulina da parte delle cellule INS1-E in maniera SIRT-1 dipendente.
STUDIO IN VIVO - L’analisi dei dati ottenuti mediante Western Blot conferma quanto osservato in vitro, evidenziando l’azione positiva di Tirosolo e Acido Ferulico sull’espressione di SIRT 1, dati avvalorati ancora di più dall’aumento statisticamente significativo di SIRT 1 rispetto al controllo nel plasma analizzato (***p<0.001).
CONCLUSIONI: I risultati dei nostri studi in vitro e in vivo confermano l’importante relazione esistente tra Acido Ferulico, Tirosolo e SIRT 1, evidenziando come queste due sostanze potrebbero trovare un’applicazione farmacologica preventiva o curativa nella patogenesi e nello sviluppo dell’obesità e del diabete.