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La serotonina, 5-idrossitriptamina (5-HT), è un neurotrasmettitore monoaminergico con una vasta distribuzione sia nei tessuti periferici che nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) dei mammiferi. A livello del SNC i neuroni che sintetizzano la serotonina si originano precocemente durante lo sviluppo embrionale, 11 giorni di gestazione (days post coitum, dpc) nel topo, e vanno a costituire i nuclei del raphe. Nonostante il loro esiguo numero rispetto ai neuroni totali presenti nel cervello, i neuroni serotoninergici innervano l'intero SNC. In questi neuroni la serotonina è sintetizzata a partire dall'L-triptofano, grazie all'attività catalitica della triptofano idrossilasi 2 (Tph2), enzima limitante per la sintesi di 5-HT. In linea con la vasta distribuzione delle innervazioni serotoninergiche, la 5-HT è implicata nella regolazione di numerosi processi fisiologici come sonno, umore, stress, appetito e comportamento sessuale.
Evidenze sperimentali sempre più numerose, tra cui l'importanza dell'apporto di 5-HT materna per il corretto sviluppo embrionale e la comparsa precoce dei recettori per la serotonina nell'embrione, corroborano l’ipotesi che la serotonina, ancora prima di svolgere la sua funzione di neurotrasmettitore, sia implicata nella regolazione di specifici processi durante lo sviluppo del SNC. In aggiunta molti dati suggeriscono che alterazioni della neurotrasmissione serotoninergica potrebbero essere alla base di patologie neuropsichiatriche con origine nello sviluppo come schizofrenia, autismo, disturbi emotivi, ansia, depressione e ritardo mentale. Grazie a modelli animali in cui la neurotrasmissione serotoninergica è alterata, è stato possibile osservare come il mantenimento dell'omeostasi della serotonina durante lo sviluppo embrionale sia essenziale per la corretta costituzione dei circuiti neuronali. Ad esempio, la generazione, nel nostro laboratorio, di una linea di topo knock-in (KI) Tph2::eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), in cui la sintesi di 5-HT cerebrale è abrogata, ha permesso di dimostrare che la serotonina è necessaria per il corretto sviluppo delle fibre serotoninergiche.
Al fine di dissezionare il ruolo della serotonina in distinte finestre temporali durante lo sviluppo del SNC e durante la vita adulta, nel nostro laboratorio è stata recentemente generata una linea knock-out (KO) condizionale per il gene Tph2, in cui il terzo esone di Tph2 è posto tra due siti loxP (FloxedTph2). Pertanto, incrociando questa linea con linee di topo che esprimono la ricombinasi Cre in maniera tempo- e spazio-specifica, è teoricamente possibile promuovere l'escissione del terzo esone che, in quanto composto da un numero di basi non multiplo di tre, causa la perdita della cornice di lettura del trascritto del gene Tph2 e la produzione di una proteina priva del dominio catalitico.
Durante il mio internato di tesi, mi sono occupata della caratterizzazione della linea FloxedTph2 per verificare che possieda i requisiti necessari per essere utilizzata in esperimenti di knock-out (KO) condizionale. Per effettuare questo tipo di analisi ho incrociato topi FloxedTph2 con topi che esprimono la ricombinasi Cre sotto il controllo di un promotore ubiquitario ottenendo una linea, che è stata denominata “Tph2Null”, in cui il terzo esone di Tph2 è stato rimosso.
I mutanti Tph2Null mostrano, rispetto ai wild-type (wt) ed ai Tph2Null +/-, un'aumentata mortalità nelle prime due settimane di vita, ed una visibile riduzione del tasso di crescita; questi aspetti del fenotipo sono in linea con quanto osservato in animali depleti di serotonina nel SNC.
Esperimenti di immunoistochimica condotti su topi Tph2Null -/- hanno mostrato che la rimozione del terzo esone del gene Tph2 risulta in una drastica riduzione della quantità di serotonina sintetizzata dai neuroni del raphe, nonostante un’analisi approfondita riveli la presenza di un esiguo quantitativo di 5-HT residua. Questo potrebbe essere spiegato ammettendo la presenza di un enzima Tph2, la cui attività catalitica sia estremamente ridotta ma non totalmente abrogata. Al fine di indagare questa ipotesi i trascritti del gene Tph2 presenti nel raphe di topi Tph2Null -/- sono stati analizzati mediante un approccio di RT-PCR e successiva analisi di sequenza. È stata così rilevata la presenza di un'isoforma di splicing del trascritto del gene Tph2, priva sia del terzo sia del quarto esone, la quale potrebbe codificare per una proteina Tph2 con attività catalitica residua.
Al fine di mettere in evidenza le fibre serotoninergiche nel topo FloxedTph2, ho generato la linea tras-eterozigote FloxedTph2/Tph2::eGPF +/- +/-. Questi animali consentono sia di ottenere una drastica riduzione tempo- e/o tessuto-specifica della sintesi di serotonina, sia di evidenziare i neuroni serotoninergici indipendentemente dall'immunoreattività della 5-HT.
Per verificare se in topi FloxedTph2/Tph2::eGPF +/- +/- l'escissione del terzo esone del gene Tph2 risulta in una riduzione della sintesi di 5-HT analoga a quella osservata nei mutanti Tph2Null e se tale riduzione produce alterazioni nello sviluppo delle fibre serotoninergiche, ho generato la linea Tph2Null/Tph2::eGPF +/- +/-. In questi animali, nonostante la presenza di un quantitativo residuo di serotonina, si osserva un evidente aumento delle innervazioni serotoninergiche a livello dell'ippocampo, in linea con il fenotipo evidenziato in topi completamente privi di 5-HT cerebrale. L'insieme di queste evidenze ci indica che la riduzione della sintesi di serotonina centrale ottenuta in seguito alla rimozione del terzo esone del gene Tph2 è tale da produrre un fenotipo per molti aspetti in linea con quello dei KO convenzionali del gene Tph2 e ci suggerisce che la linea FloxedTph2 possa essere utilizzata in esperimenti di KO condizionale. Pertanto la linea FloxedTph2/Tph2::eGFP è stata impiegata in associazione con il sistema inducibile CMV-CreERT2/Tamoxifen per ottenere una drastica riduzione dei livelli di 5-HT centrale a stadi post natali ed in animali adulti. La messa a punto di questo sistema, consentirà di studiare se l'abrogazione della sintesi di serotonina in topi adulti, in cui i circuiti serotoninergici si sono già costituiti, comporti alterazioni a carico del fenotipo delle fibre serotoninergiche. In aggiunta, sarà possibile indagare a quali stadi durante lo sviluppo, l'apporto di un adeguato quantitativo di 5-HT neuronale sia essenziale per la corretta costituzione dei circuiti serotoninergici.