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La serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT) è un neurotrasmettitore implicato nella modulazione di numerosi processi fisiologici, come il controllo dell'appetito, il sonno, la memoria, l'umore, lo stress e il comportamento sessuale. I neuroni serotoninergici costituiscono uno dei sistemi neuronali più ampiamente distribuiti all'interno del cervello dei mammiferi. Questi neuroni si raggruppano in due cluster: il cluster rostrale che innerva tutte le strutture del cervello anteriore, e il cluster caudale che proietta verso il midollo spinale. Oltre alle funzioni menzionate prima, numerose evidenze hanno portato ad ipotizzare che la serotonina abbia un ruolo durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC): l'inizio della sintesi di 5-HT e l'espressione dei suoi recettori a stadi embrionali precoci, la disponibilità di 5-HT materna, la comparsa delle fibre serotoninergiche nel telencefalo ad uno stadio in cui ha luogo la proliferazione, migrazione e differenziamento delle cellule neuroepiteliali in neuroni. Inoltre è noto che disfunzioni della neurotrasmissione serotoninergica siano all'origine di disordini neuropsichiatrici come schizofrenia, autismo, ritardo mentale, ansia e depressione. Secondo la cosiddetta "ipotesi delle monoammine", la depressione avrebbe, tra le possibili cause ,un ipofunzionamento del sistema serotoninergico, che produrrebbe alterazioni anche a carico di altri sistemi di neurotrasmissione, come quello noradrenergico e dopaminergico. Poichè l'eziologia della depressione è tutt'altro che chiara, è di fondamentale importanza riuscire a svelarne la patogenesi e quali sono le alterazioni che provocano questo disordine. Tra i farmaci attualmente impiegati per il trattamento della depressione ci sono gli inibitori selettivi del reuptake della serotonina (SSRI). Questi hanno un effetto terapeutico dopo 2/3 settimane dell'inizio della somministrazione ed inoltre la terapia rimane sub-ottimale in quanto circa il 40% dei pazienti non risponde al trattamento. Una valida alternativa entrata recentemente in uso è la ketamina, antagonista non competitivo dei recettori NMDA, che produce effetti antidepressivi molto rapidi (ore) e risulta efficace in pazienti resistenti al trattamento con SSRI.
Per studiare il ruolo della serotonina durante lo sviluppo del SNC e il suo coinvolgimento nell'eziologia di disordini neuropsichiatrici come la depressione, nel nostro laboratorio è stata generata una linea murina knock-in Tph2::eGFP (Migliarini et al. 2012), in cui il primo esone del gene Tph2, che codifica per l'enzima limitante la sintesi di 5-HT, è stato rimpiazzato dal gene reporter GFP. Gli animali Tph2::eGFP -/-, privi di 5-HT nel SNC, mostrano un'aumentata mortalità nelle prime tre settimane di vita ed un grave deficit di crescita. Inoltre, grazie all'espressione selettiva della GFP nei neuroni serotoninergici, è stato possibile mettere in evidenza un alterato sviluppo delle fibre, tempo e regione specifico: una riduzione dell'innervazione serotoninergica nei nuclei suprachiasmatico dell'ipotalamo e paraventricolare del talamo, e una iperinnervazione nel nucleus accumbens e nell'ippocampo (Migliarini et al. 2012) .
Durante il mio internato di tesi, mi sono occupato della caratterizzazione della linea murina Tph2::eGFP sotto due aspetti: da un lato ho proseguito ed approfondito l'analisi dello sviluppo delle fibre serotoninergiche nel sistema nervoso centrale, dall'altro, attraverso test comportamentali e analisi molecolari, ho iniziato un progetto teso a chiarire quale potesse essere il ruolo della serotonina nel meccanismo d'azione della ketamina.
Ho inizialmente effettuato esperimenti di immunoistochimica, grazie ai quali è stato possibile mettere in evidenza che i topi Tph2::eGFP -/- mostrano, rispetto a topi eterozigoti, un'aumentata innervazione serotoninergica in diverse regioni del cervello: corteccia prefrontale, setto laterale, substantia nigra e area tegmentale ventrale. Tra queste aree, poichè è nota una stretta correlazione tra il sistema serotoninergico e quello dopaminergico, ho concentrato la mia attenzione sulla substantia nigra e sull'area tegmentale ventrale. Mi sono chiesto se l'assenza di 5-HT e/o il marcato aumento delle fibre serotoninergiche potessero avere una qualche influenza sullo sviluppo del sistema dopaminergico. Effettuando esperimenti di immunoistochimica per evidenziare il sistema dopaminergico, ho osservato che negli animali Tph2::eGFP -/- è presente uno sviluppo alterato dei neuroni dopaminergici. Attraverso esperimenti di ibridazione in situ, è emerso che i topi Tph2::eGFP -/- presentano una diminuzione del numero di neuroni dopaminergici di circa il 30% rispetto a topi wild-type, sia nella substantia nigra che nell'area tegmentale ventrale. E' la mancanza di serotonina o l'aumento delle fibre serotoninergiche nei nuclei di origine dei neuroni dopaminergici a causare questo fenotipo? Per rispondere a questa domanda, ho utilizzato una linea murina in cui il sistema serotoninergico è ablato in seguito all'espressione specifica della tossina difterica all'interno di questi neuroni. Attraverso esperimenti di immunoistochimica e ibridazione in situ, ho osservato che il numero dei neuroni dopaminergici non varia tra animali di controllo e animali che non presentano neuroni serotoninergici. Ulteriore supporto all'ipotesi che sia l'iperinnervazione serotoninergica ad influenzare negativamente lo sviluppo dei nuclei dopaminergici mesencefalici, deriva dalla constatazione che nei topi Tph2::eGFP -/- i neuroni dopaminergici dell'ipotalamo, regione in cui non è presente un'alterazione delle proiezioni serotoninergiche, si sviluppano correttamente e sono presenti in ugual numero rispetto ai controlli.
Per analizzare il ruolo della serotonina nel meccanismo d'azione della ketamina, i topi Tph2::eGFP -/- sono stati sottoposti a due test comportamentali, il Forced Swim e il Tail Suspension Test, per valutare comportamenti antidepressant-like in seguito a somministrazione di ketamina. Dati preliminari mostrano che gli animali mutanti per Tph2 rispondono a dosi di ketamina che nei topi wild type non hanno mostrato avere effetto. E' stato ipotizzato che l'effetto antidepressivo della ketamina sia mediato dall'aumento d'espressione della neurotrofina Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) nell'ippocampo e della sinaptogenesi nella corteccia prefrontale, con formazione di nuove spine dendritiche. Uno dei fattori che potrebbe contribuire al fenotipo osservato potrebbe essere l'aumento d'espressione di BDNF nell'ippocampo dei topi Tph2::eGFP -/- già in condizioni basali (Migliarini et al. 2012). Per capire a cosa sia dovuta la maggiore responsività dei topi Tph2::eGFP -/- al trattamento antidepressivo con la ketamina rispetto ai topi di controllo, sono in progetto esperimenti volti a valutare se una maggiore risposta di BDNF nell'ippocampo, unita ad un aumentato livello di sinaptogenesi corticale, possa essere la causa del fenotipo osservato