• BRAF
• melanoma
• miR-204
• miRNA
• sensore
• sponge
• vemurafenib

Riassunto
Il melanoma è un cancro maligno della pelle caratterizzato da un’alta propensione per la metastasi e da una considerevole resistenza agli agenti chemioterapici. Circa il 50% dei melanomi presenta una mutazione della chinasi BRAF nel residuo V600. Tale mutazione provoca l’attivazione costitutiva del pathway delle MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) e dunque una divisione incontrollata delle cellule con conseguente sviluppo del tumore. Ad oggi il farmaco più utilizzato per trattare il melanoma con mutazione su BRAF è rappresentato dal Vemurafenib (PLX4032), il quale compete con l’ATP per il legame a BRAF mutato, inibendo così l’attività chinasica di quest’ultimo. Il Vemurafenib risulta molto efficace nei primi mesi di trattamento, tuttavia in seguito i pazienti sviluppano una “resistenza acquisita” contro il farmaco, per cui questo diventa inefficace.
Allo scopo di identificare nuovi possibili target terapeutici da affiancare al Vemurafenib per potenziarne l’efficacia e magari prevenire la resistenza acquisita, la mia tesi è stata volta a studiare i miRNA regolati da BRAFV600E nel melanoma.
Inizialmente è stato eseguito un deep sequencing sulla linea parentale A375 (sensibile al Vemurafenib), con e senza trattamento col farmaco. Come controllo è stato usato un clone, derivante dalla stessa linea parentale, ma resistente al farmaco. Questo schema sperimentale è stato usato per poter identificare quei miRNA che fossero modulati dal farmaco (cioè dall’inibizione di BRAFV600E) nella linea parentale e che al contempo non variassero nel clone resistente. Il deep sequencing ha indicato il miR-204 come top scoring tra i miRNA sovraespressi a seguito del trattamento con Vemurafenib nella linea parentale. Il miR-204 differisce per sole due basi (al di fuori del seed) da un altro miRNA della stessa famiglia (il miR-211) e l’espressione differenziale di entrambi i miRNA è stata confermata tramite Real Time PCR sulla linea cellulare su cui è stato effettuato il deep sequencing così come su altre linee.
A questo punto il mio lavoro si è concentrato sullo studio degli effetti biologici derivanti dalla modulazione dei livelli del miR-204 e del miR-211 in varie linee cellulari di melanoma metastatico. In particolare, sono stati studiati gli effetti causati dalla sovraespressione stabile o transiente di entrambi i miRNA. Si è così ottenuto che le cellule crescono meno e producono più melanina (indizio di una possibile induzione verso il differenziamento).
In seguito sono stati studiati gli effetti causati dall’inibizione di questi due miRNA ottenuta tramite transfezione transiente di un LNA. Si è così potuto riscontrare che l’inibizione del miR-204 causa un forte aumento dell’apoptosi.
Per validare, tramite infezione stabile, i risultati ottenuti con la transfezione transiente dell’LNA, abbiamo quindi proceduto con la costruzione di una sponge. La sponge è un RNA contenente vari siti di legame imperfetti per il miRNA di interesse che sono in grado di inibire l’attività di quel miRNA. Sono state costruite tramite clonaggi una sponge con 6 ripetizioni del sito di legame per il miR-204, una per il miR-211 ed una contenente un sito di legame scrambled (che non lega alcun miRNA) come controllo. Tramite saggi di luciferasi è stato dimostrato il corretto funzionamento delle sponge, anche se non è stata osservata specificità per il miR-204 o il 211 da parte di nessuna delle due sponge. Su questo fronte questo studio continuerà con l’inserimento delle sponge all’interno di vettori virali per effettuare infezioni stabili all’interno delle varie linee tumorali a disposizione. Per quest’ultima parte è stata costruita anche una sponge contenente 6 ripetizioni contro il miR-204 e 6 ripetizioni contro il miR-211 (nonché una sponge con 12 ripetizioni dello scrambled) al fine di inibire entrambi i miRNA senza saturare la sponge (come probabilmente accadrebbe utilizzando una sponge con sole 6 ripetizioni contro uno dei due miRNA, vista la mancanza di specificità).
Infine, l’ultima parte della mia tesi è stata dedicata alla costruzione di un sensore per il miR-204. Questo costrutto permetterà di separare (tramite Cell Sorting) le cellule di una determinata linea sulla base dei livelli di espressione del miRNA di interesse (low/medium/high expression). Sarà così possibile studiare le differenze biologiche eventualmente esistenti tra i vari gruppi di cellule.
Complessivamente, i costrutti sponge e il sensore che sono stati ottenuti nel mio lavoro di tesi permetteranno di studiare in modo più approfondito il ruolo biologico svolto dalla miR-204 family nelle cellule di melanoma e contribuiranno a definirne la relazione con il MAPK pathway.

Abstract
Melanoma is a malignant cancer of the skin characterized by a high propensity for metastasis and a considerable resistance to chemioterapic agents. About 50% melanomas show a mutation in the kinase BRAF at the residual V600 residue. This mutation elicits the constitutive activation of the MAPK pathway (Mitogen-Activated Protein Kinase) and therefore an uncontrolled cellular proliferation. To date Vemurafenib (PLX4032) is the most used drug to treat melanoma with a mutated BRAF. This drug competes with ATP for the binding to mutated BRAF, so it inhibits the kinase activity of BRAF itself. Vemurafenib is very effective in the first months of treatment, but then patients develop an “acquired resistance” against the drug, which become ineffective.
In order to identify new possible therapeutics targets to increase Vemurafenib efficacy and prevent acquired resistance, my thesis was focused on the study of BRAF-regulated miRNAs in melanoma.
Initially a deep sequencing was performed on the parental cell line A375 (sensitive to Vemurafenib), with and without drug treatment. As a control we used a clone derived from the same parental cell line and resistant to the drug. This experimental strategy was used to identify those miRNAs that were drug-modulated in the parental cell line and at the same time that did not change in the resistant clone. The deep sequencing indicated miR-204 as top scoring among the upregulated miRNAs after drug treatment in the parental cell line. miR-204 is different from another miRNA of the same family (miR-211) for just two bases (out of the seed). The differential expression of both the miRNA was confirmed trough Real-Time PCR on the parental cell line A375 as well as on other lines.
At this point, my work focused on the study of the biological effects derived from the modulation of miR-204 and miR-211 levels in several metastatic melanoma cell lines. In particular, we studied the effects caused by the stable or transient miR-204 and miR-211 overexpression. We obtained a decrease in cell growth and an increase in melanin production (that is a clue of a possible induction of differentiation).
Then we studied the effects caused from both miRNA inhibition. This was obtained through LNA transient transfection. In this way we saw that miR-204 inhibition causes a strong increase of apoptosis.
Then we proceeded with the cloning of a sponge construct for a future stable expression to validate the results obtained through LNA transient expression. A sponge is a RNA containing several imperfect binding sites for the miRNA of interest and is capable to bind (and inhibit) the activity of that miRNA. We cloned a sponge with six repeats of the miR-204 binding site, then one with six repeats of the miR-211 and a third one containing a miRNA scrambled binding site as a control. Through luciferase assay, we finally demonstrated the correct functioning of the sponges, but we did not observe specificity for miR-204 or miR-211. This work will continue with the insertion of the sponge within viral vectors to effectuate stable infections into several tumor cell lines. To this end we cloned a sponge containing six repeats against miR-204 and six repeats against miR-211 (as well as a sponge with twelve repeats of the scrambled binding site) to inhibit both miRNA, without saturate the sponge (as it would probably happen using a sponge with six repeats against one of the two miRNA, due to lack of specificity).
Finally, the last part of my thesis was dedicated to the construction of a miR-204 sensor. This construct will allow (through Cell Sorting) to divide the cells of a specific cell line according to the expression levels of miR-204 (low/medium/high expression). In this way, we will be able to study the biological differences that exist among several cell groups.
Overall, the sponge and sensor constructs obtained in my thesis work will permit to examine in depth the biological role carried out by miR-204 family in melanoma cells and will contribute to define its relationship with the MAPK pathway.