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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-10012013-155304


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
GHESER, FEDERICA
URN
etd-10012013-155304
Titolo
Effetti della stimolazione ripetuta del nervo trigemino sulle risposte cardiovascolari nel ratto e meccanismi molecolari coinvolti
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Relatori
relatore Dott.ssa Scuri, Rossana
Parole chiave
  • eNOS
  • estensione mandibolare
  • microcircolo cerebrale
  • ratto
  • stimolazione trigeminale
Data inizio appello
21/10/2013
Consultabilità
Completa
Riassunto
È noto che manipolazioni eseguite nelle regioni facciali inducono risposte neurovegetative quali ipotensione e bradicardia. Recentemente, è stato osservato, in soggetti volontari normotesi, che una breve (10 min) estensione sub massimale della mandibola (EM) causa una prolungata e significativa riduzione della pressione arteriosa sistemica (PA) e della frequenza cardiaca (FC). È stato ipotizzato che tali effetti siano dovuti alla stimolazione delle branche periferiche del nervo trigemino. Utilizzando il ratto come modello animale, è stato possibile riprodurre gli effetti, osservati nell’uomo, di 10 min di EM indotta con uno speciale divaricatore posto tra le arcate dentarie dell’animale. In particolare è stato visto che la riduzione di PA media (PAm) e di FC permaneva fino a 140 min dal termine di EM e tali effetti erano mediati dall’attivazione del nervo trigemino. Nel ratto, a livello cerebrale, 10 min di EM inducevano anche una caratteristica regolazione del microcircolo piale in quanto durante EM le arteriole costringevano per poi dilatarsi dopo la rimozione del divaricatore; la vasocostrizione era abolita dall’applicazione per via endovenosa di naloxone, un inibitore dei nocicettori, mentre la vasodilatazione scompariva dopo applicazione locale o per via sistemica di L-Name, un inibitore aspecifico delle NO sintetasi. Ciò suggerisce che durante EM vi sia attivazione di vie nocicettive che indurrebbero il rilascio di fattori vasocostrittori e l’innesco del rilascio di NO che agirebbe successivamente producendo la vasodilatazione osservata nel periodo post EM.
Nella prima parte del presente lavoro di tesi sono stati indagati più in dettaglio i meccanismi responsabili della vasodilatazione delle arteriole piali post EM. A tale scopo sono stati utilizzati ratti maschi adulti del ceppo Wistar (250-300 grammi), sottoposti ad una singola EM di 10 minuti dopo un periodo di osservazione basale della durata di 30 minuti, e quindi tenuti sotto osservazione per un periodo di 180 minuti. Durante le varie fasi sperimentali sono state misurate PAm, mediante catetere posto in arteria femorale, FC mediante registrazione di ECG e attraverso una tecnica di microscopia in fluorescenza sono state visualizzate le arteriole piali a livello della corteccia parietale (area dove proiettano la maggior parte delle afferenze trigeminali) per poter poi procedere off-line alla misura del diametro. Le ritmiche oscillazioni a cui è sottoposto il diametro delle arteriole sono state analizzate con metodi matematici (analisi spettrale) su acquisizioni di almeno 30 minuti effettuate durante il periodo di osservazione basale e circa a metà del periodo post EM.
I risultati ottenuti hanno confermato che una singola EM produce una riduzione di PAm e FC che permane fino a 140 minuti post EM. Le variazioni del diametro delle arteriole osservate hanno evidenziato la vasocostrizione che accompagna EM seguita da vasodilatazione che perdurava per tutto il periodo di osservazione post EM.
Dall’analisi spettrale è emerso che le oscillazioni a bassissima frequenza, correlate all’attività endoteliale, aumentavano nel post EM rispetto al basale.
Poiché il principale mediatore della vasodilatazione a livello cerebrale è rappresentato dall’ossido nitrico (NO) rilasciato dalle cellule endoteliali in risposta a stimolazione meccanica della parete dei vasi e dai neuroni, abbiamo valutato l’espressione nel tempo dei geni che codificano per le tre isoforme della sintetasi dell’ossido nitrico (endoteliale, eNOS; neuronale, nNOS; inducibile, iNOS) a livello della corteccia parietale in ratti sacrificati, prima, subito dopo EM e a 1, 2 o 3 ore rispettivamente dalla rimozione del divaricatore.
L’analisi dell’espressione genica effettuata attraverso PCR real-time ha dimostrato che l’espressione del gene per eNOS era significativamente aumentata a 2 ore post EM per poi diminuire a 3 ore, mentre l’espressione del gene per nNOS non ha subito modificazioni significative. L’espressione del gene per iNOS, addirittura era significativamente ridotta rispetto al basale in tutte le fasi sperimentali considerate.
Mediante Western blot, eseguito su estratti di proteine ottenuti da campioni di corteccia parietale dissezionata da cervelli di ratti sacrificati 2 ore dopo EM ha confermato un aumento dell’espressione della sola proteina eNOS.
Questi risultati nel loro complesso indicano che la vasodilatazione osservata dopo EM è sostenuta da un aumento di NO prodotto dalla eNOS, cioè dall’attivazione dell’endotelio in seguito a variazioni del flusso ematico, probabilmente dovute ai meccanismi di autoregolazione del circolo cerebrale attuati in risposta alla riduzione di PAm e FC indotta da EM, piuttosto che dall’attività dei neuroni che elaborano l’ informazione trigeminale. Inoltre, la ridotta espressione del gene di iNOS, indica che EM non innesca processi infiammatori.
Dal momento che una singola EM produce interessanti effetti sui parametri cardiovascolari ed emodinamici che potrebbero suggerire una sua applicazione nel controllo del regime pressorio in condizioni fisiologiche e patologiche, nella seconda parte del lavoro di tesi abbiamo cercato di definire protocolli sperimentali di EM ripetute che potessero prolungare nel tempo gli effetti di una singola EM.
Abbiamo valutato quindi gli effetti di una seconda EM della durata di 10 minuti eseguita al termine del periodo di osservazione dopo la prima EM, quando i parametri studiati hanno recuperato i valori basali.
La seconda EM ha prodotto una riduzione di PAm e di FC di entità paragonabile a quella causata dalla prima EM, ma che perdurava molto più a lungo rispetto ad essa, fino a 240 minuti, tempo al termine del quale è stato interrotto l’esperimento. Per quanto riguarda invece gli effetti sul microcircolo piale è stato osservato che la seconda EM non era accompagnata da vasocostrizione e la vasodilatazione determinata dalla prima EM perdurava della stessa entità per tutto il periodo di osservazione successivo alla seconda EM.
Queste osservazioni sperimentali rappresentano un punto di partenza per l’elaborazione di protocolli da attuare nel trattamento clinico ad esempio di stati ipertensivi.
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