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RIASSUNTO

Il sangue umano costituisce il materiale di partenza per la produzione di numerosi farmaci usati per la prevenzione ed il trattamento di varie malattie ad esito spesso fatale: è per questo motivo che la sicurezza di tali prodotti riveste un’importanza fondamentale.
D’altronde, nelle ultime due decadi, sono stati fatti notevoli progressi nel ridurre il rischio di contaminazione da parte di eventuali agenti patogeni, raggiungendo un elevato livello di sicurezza attraverso tre approcci complementari a partire dalla selezione dei donatori di sangue, al controllo delle donazioni e dei pool di plasma destinati alla produzione dei farmaci, fino all’introduzione di procedure di rimozione e/o inattivazione dei patogeni nel processo produttivo.
Ad ogni modo i produttori di farmaci plasma-derivati continuano a ricercare e a valutare nuovi metodi di rimozione e/o inattivazione e a migliorare le procedure di purificazione allo scopo di ridurre eventuali rischi residui di contaminazione da parte di agenti infettivi che potrebbero essere presenti nei pool di plasma.
Tra gli agenti di scoperta più recente si annovera la forma infettiva della proteina prionica (PrPres o PrPSc) che è stata isolata nel cervello di uomini e animali affetti da varie forme di malattie neurodegenerative compresa la variante umana del morbo di Creutzfeldt-Jakob (vCJD) comparsa in seguito al diffondersi dell’epidemia di BSE nel Regno Unito.
Il suo ritrovamento in questa particolare classe di malattie neurodegenerative ha permesso di eleggerla quale loro marcatore altamente specifico.
La nuova variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD) ha messo in evidenza un ampio coinvolgimento linforeticolare, suscitando il timore riguardo la possibilità di trasmissione della malattia da individui infetti in una fase preclinica attraverso trasfusioni di sangue e/o emoderivati.
Da qui nasce l’esigenza di avere un metodo robusto ed affidabile per la rilevazione dell’eventuale presenza di PrPSc proprio nei farmaci plasma-derivati.
L’obiettivo di questa tesi è lo sviluppo e la validazione di un metodo analitico per la determinazione semi-quantitativa dell’isoforma infettiva di proteina prionica. La convalida del metodo analitico, condotta presso Kedrion S.p.A., ha lo scopo di applicare questo metodo in routine per la titolazione della PrPSc in studi preclinici di safety di prodotti plasmatici.
Il metodo è stato validato utilizzando come matrice di partenza omogenato di cervello di criceti infettati con la proteina prionica. Dopo la digestione con proteinasi K, per ogni campione sono state effettuate diluizioni seriali che sono state sottoposte a corsa elettroforetica e successivo Western Blotting per individuarne il titolo.
Il metodo è stato validato per:
linearità: calcolata in base al coefficiente di correlazione della curva di taratura, ponendo come limite di accettazione un valore pari o superiore a 0,95. Il metodo risulta lineare da 0.6 a 4.6 Log/ml;
accuratezza: calcolata in base a quanto il metodo è capace di ottenere risultati prossimi al valore vero. Il valore medio di recupero dei campioni analizzati per ogni livello di concentrazione deve essere compreso tra 80% e 120% rispetto al valore teorico. Il metodo risulta accurato da 0.6 a 4.6 Log/ml;
precisione intermedia: è definita come il grado di precisione dei risultati analitici ottenuti in condizioni operative diverse all’interno dello stesso laboratorio di analisi ed è calcolata in base alla deviazione standard per ogni titolo testato. Per ogni titolo la deviazione standard è risultata essere inferiore a 0,5 Log, limite di accettazione stabilito per tale prova;
precisione entro la serie: valuta la riproducibilità del metodo analitico intra saggio. Il metodo è ripetibile nell’intervallo 0.6-4.6 Log/ml;
robustezza: Il metodo è risultato robusto in quanto la differenza fra titolo teorico e titolo ottenuto per tutte le repliche alle condizioni di massimo e minimo è rientrato nei criteri di accettazione perché inferiore a 0,5 Log;
limite di quantificazione: corrisponde al limite inferiore del range della metodica ed è risultato pari a 0.5 Log/ml.