• acetilcolina
• bicucullina
• ciclotiazide
• epilessia
• nuclei colinergici
• proencefalo basale
• SE
• stato epilettico

Background
L’epilessia del lobo temporale (TLE) è la forma di epilessia più comune in età adulta, rappresentando da sola il 30-35% di tutte le epilessie. Nella TLE, la sede di origine delle crisi generalmente è a livello di strutture temporali allo- o meso-corticali, giustificando l’appellativo di crisi limbiche agli eventi ictali che ne costituiscono la classica manifestazione clinica. Nella storia di malattia della TLE, può accadere che i meccanismi di autolimitazione, che fanno della crisi un fenomeno transitorio, usualmente di durata inferiore ai 2-3 minuti, falliscano e che conseguentemente le crisi si protraggano a lungo o si succedano in rapida frequenza senza interruzioni. Una simile attività convulsiva continua che si protrae per oltre 10 minuti, a livello delle strutture limbiche, provoca morte neuronale e configura un cosiddetto stato epilettico (SE).
È noto che i fenomeni degenerativi conseguenti a SE limbico interessano le varie strutture cerebrali reclutate dal circuito epilettogeno. Tra le aree potenzialmente coinvolte nella propagazione delle crisi limbiche, finora, sorprendentemente, non è mai stato studiato l’interessamento dei nuclei colinergici del proencefalo basale (nucleo basale del Meynert - NBM, nucleo mediale del setto - NMS e nucleo della benderella diagonale di Broca - nBDB), anch’essi del sistema limbico. Dato, inoltre, il ruolo preponderante di questi nuclei in numerose funzioni cognitive quali la memoria, l’attivazione cerebrale, l’attenzione, il ciclo sonno-veglia, l’orientamento spaziale e il riconoscimento di nuovi stimoli, l’analisi del loro coinvolgimento rappresenta un elemento essenziale.
Riuscire a stabilire l’esistenza di un rapporto causale tra stato epilettico e degenerazione cerebrale è un obiettivo cruciale. Non è possibile dirimere tale questione nell’uomo, in cui non possiamo distinguere un “prima” e un “dopo” nella degenerazione, pure verificata sui tessuti autoptici di pazienti con TLE (ampiamente descritta è la sclerosi ippocampale). Diversamente, i modelli animali possono riconoscere la causalità degli eventi e la direzione intrapresa dal processo patogenetico.
La maggioranza dei modelli sperimentali di epilessia temporale si basa, tutt’oggi, sull’iniezione di chemoconvulsivanti per via sistemica (fra tutti spiccano l’acido kainico e la pilocarpina, per gli innumerevoli modelli risalenti già agli anni Settanta). Tuttavia, questi modelli presentano molti limiti. Innanzitutto, i. non disponiamo di sostanze esclusivamente epilettogene, che non abbiano ulteriori effetti sul tessuto cerebrale (limite che si ripropone per qualsiasi modello sistemico farmacologico di epilessia). Inoltre, ii. le dosi di convulsivanti necessarie a dare crisi sono puntualmente maggiori delle dosi sufficienti a provocare danno neuronale; pertanto questi generano danno cellulare più facilmente delle crisi epilettiche. iii. La diffusione sistemica del chemoconvulsivante non consente di attribuire alcuna specificità di sede alle alterazioni cerebrali osservate. Questi limiti rendono impossibile distinguere il danno provocato dalla propagazione della scarica epilettica da quello eccitotossico del chemoconvulsivante. Questo si verifica anche per cambiamenti funzionali indotti dall’epilessia in quanto, i chemoconvulsivanti alterano la connettività dei circuiti epilettici.
Occorre inoltre considerare che i chemoconvulsivanti, quando iniettati per via sistemica modificano numerosi parametri vitali. Questi, come la pressione arteriosa, la temperatura corporea, la frequenza cardiaca, l’integrità della barriera emato-encefalica, sono tutti in grado di modificare di per sé la soglia epilettica.
L’alterazione spuria della soglia epilettica e il danno neuronale aspecifico rendono inattendibile un modello che si propone di indagare la natura e la sede delle conseguenze degenerative di uno SE.
Il modello utilizzato in questo lavoro di Tesi è stato scelto per evitare tali artefatti sperimentali. Lo SE sperimentale viene indotto da microinfusione focale nella CPA.
Quest’area è stata denominata da Karen Gale area tempestas e corrisponde all’area del sistema nervoso con più bassa soglia epilettogena. Quest’area, corrispondente alla corteccia piriforme anteriore (CPA), dimostrata inizialmente nei roditori, è stata poi identificata nei primati non umani ed infine, da pochi mesi, nell’uomo.
La suscettibilità epilettogena della CPA è spiccata e la sua farmacologia è basata soprattutto sull’attività di GABA e glutammato. Le crisi episodiche possono essere indotte da microinfusioni di poche picomoli di bicucullina (antagonista GABA-A).
Quando invece la bicucullina viene microinfusa in condizioni di alterata funzionalità dei recettori AMPA per il glutammato, si verifica SE. Tale alterazione viene indotta bloccando la desensitizzazione, cui normalmente i recettori AMPA vanno incontro dopo uno stimolo. La molecola in grado di bloccare la desensitizzazione si chiama ciclotiazide. La ciclotiazide non è in grado da sola di provocare epilessia, tuttavia quando somministrata con bicucullina produce SE, per la durata di ore.

Obiettivo
Avendo a disposizione un modello focale di SE limbico (ciclotiazide + bicucullina) in CPA, abbiamo valutato specificamente l’integrità dei nuclei colinergici del proencefalo basale.
La valutazione è stata condotta sia dal punto di vista morfologico descrittivo, sia in modo quantitativo assoluto con la conta stereologica dei singoli nuclei.

Metodi
Lo studio è stato effettuato in Ratti del ceppo Sprague-Dawley. I ratti sono stati sottoposti, in anestesia totale, a microchirurgia stereotassica per l’impianto cronico di microcannula guida in corrispondenza di CPA. Successivamente, tramite cannula da microinfusione, una parte degli animali ha ricevuto il trattamento combinato con Ciclotiazide (200pmol in120nL) + Bicucullina (118 pmol in120nL), una parte ha ricevuto soltanto ciclotiazide, un ulteriore gruppo ha ricevuto la sola bicucullina e un ultimo gruppo è stato microinfuso con solo veicolo (soluzione salina).
Dopo l’infusione, le crisi epilettiche sono state valutate dal punto di vista comportamentale secondo la scala di Racine e monitorate con EEG, che ha consentito di identificare un basso grado e un alto grado di SE.
A distanza di tempo dallo SE che si è risolto in alcune ore dall’infusione, gli animali sono stati sacrificati.
Gli encefali sono stati rimossi e conservati ed infine inclusi in paraffina. Alcune sezioni distanziate tra loro in base a procedure stereologiche sono state colorate con tecniche istochimiche ed immunoistochimiche, queste ultime hanno utilizzato enzimi specifici per neuroni colinergici (colina-acetil trasferasi, ChAT).

Risultati
Dati comportamentali
Lo SE è insorto mediamente 5±2min dopo il termine dell’infusione dei chemoconvulsivanti ed ha avuto una durata media di 235 ± 22 min; i due gruppi individuati in base alla severità di crisi hanno manifestato una simile incidenza di crisi e assenza di una differenza significativa nella durata media dello SE.
Dati istologici e immunoistochimici
Nella CPA, la perdita neuronale è avvenuta nel sito di infusione, e anche controlateralmente, dopo crisi di alto grado.
In ippocampo, la perdita neuronale è avvenuta sempre bilateralmente (aree CA1 e CA3).
Nel nucleo basale del Meynert la perdita neuronale colinergica è risultata massiva, ma ancora maggiore quella misurata nel nucleo mediale del setto e nel nucleo della benderella diagonale di Broca.
In generale, vi è stata una correlazione tra gravità delle crisi e quantità di perdita neuronale nei nuclei colinergici.

Conclusioni
Lo stato epilettico limbico determina una severa perdita neuronale nei nuclei colinergici del proencefalo basale (NBM, NMS, nBDB).
Questo modello di induzione puramente focale di SE di origine limbica consente di escludere artefatti sperimentali e di attribuire la perdita neuronale alla diffusione della scarica epilettica dalla CPA ei nuclei colinergici.
I molteplici parallelismi tra questo modello e lo SE limbico, che si verifica in molti pazienti con TLE, consentono di estendere il rapporto tra crisi limbiche prolungate e alterazioni cognitive.
Infatti, nei pazienti con TLE si verificano frequentemente disturbi di working memory, che per la prima volta trovano un substrato neurobiologico plausibile.