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Thesis etd-09282012-145347


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
MARESCA, LUISA
email address
luisamaresca@hotmail.com
URN
etd-09282012-145347
Thesis title
Valutazione del ruolo del gene MSH2 nel tumore familiare della mammella e dell'ovaio
Department
BIOLOGIA
Course of study
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Prof. Bevilacqua, Generoso
relatore Dott.ssa Caligo, Maria Adelaide
correlatore Prof. Cercignani, Giovanni
correlatore Prof.ssa Sbrana, Isabella
Keywords
  • BRCA1
  • MSH2
  • tumore familiare della mammella e dell'ovaio
Graduation session start date
18/10/2012
Availability
Partial
Release date
18/10/2052
Summary
Il tumore della mammella è la neoplasia più comune nelle donne. Circa l’80% dei carcinomi mammari è di tipo sporadico mentre il rimanente 20% è rappresentato dai casi familiari, dei quali circa il 20-40% è dovuto a mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2.
BRCA1 è un gene oncosoppressore che codifica per una fosfoproteina nucleare coinvolta in numerosi processi cellulari tra cui la riparazione del DNA, il controllo del ciclo cellulare e il mantenimento della stabilità genomica. E’ noto che BRCA1 interagisce con numerose proteine coinvolte nei processi di ricombinazione omologa e non omologa e nel mismatch repair.
BRCA1 è un gene altamente polimorfico con circa 1500 varianti uniche documentate. Alcune mutazioni portano alla produzione di una proteina tronca e non funzionale, che può causare l’insorgenza del tumore della mammella e dell’ovaio. Inoltre sono state identificate molte mutazioni missenso, definite VUS (variants of unknown significance) di cui non è noto il significato patologico.
Recentemente nel nostro gruppo di ricerca è stato messo a punto un saggio funzionale che valuta la patogeneticità di alcune VUS di BRCA1 tramite l’analisi del loro effetto sulla ricombinazione omologa nel lievito Saccharomyces cerevisiae. I risultati di questo lavoro hanno dimostrato che l’espressione di BRCA1wt e delle VUS neutre non induce aumento di ricombinazione nel ceppo diploide di S. cerevisiae RS112, mentre l’espressione di varianti patogenetiche determina un significativo aumento della ricombinazione.
Lo studio all’interno del quale si inserisce questo progetto di tesi ha lo scopo di determinare quali tra i partner del gene BRCA1, noti o meno, coinvolti nei processi di ricombinazione omologa, non omologa e mismatch repair possono contribuire all’insorgenza e alla progressione del tumore alla mammella e dell’ovaio.
S. cerevisiae è un ottimo sistema modello per la determinazione del ruolo dei pathways di riparazione del DNA nell’instabilità genomica indotta da BRCA1 poiché, anche se non possiede il gene omologo di BRCA1, conserva gli stessi pathways di riparazione presenti nell’uomo. In esperimenti precedenti sono state valutate le frequenze degli eventi di ricombinazione omologa, non omologa e mutazione genica in un ceppo aploide (RSY6) wild type o difettivo nei pathways di riparazione che esprimeva la proteina BRCA1 umana wild type o con le VUS. E’ stato visto che l’espressione di BRCA1wt nel ceppo RSY6wt non ha effetto nè sulla ricombinazione omologa né sulla frequenza di mutazione genica. Invece nel ceppo RSY6msh2∆ (deleto per il gene MSH2), che ha un livello basale di ricombinazione pari al 50% rispetto al wt, l’espressione di BRCA1wt aumenta la ricombinazione di circa tre volte e fa raddoppiare la mutazione genica. Questi dati suggeriscono che il gene MSH2 potrebbe avere un ruolo nell’instabilità genomica indotta da BRCA1.
Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di effettuare un’analisi mutazionale, dei riarrangiamenti e dell’espressione proteica di MSH2, in un gruppo di carcinomi della mammella e/o dell’ovaio di pazienti carrier delle VUS di BRCA1. L’ipotesi di partenza è che, se BRCA1 e MSH2 cooperano nel processo di trasformazione neoplastica del tumore mammario e ovarico, nei pazienti carrier delle VUS di BRCA1 avremmo dovuto identificare mutazioni in MSH2 e che tali mutazioni avrebbero potuto essere localizzate nei siti di interazione con BRCA1. L’analisi mutazionale è stata condotta tramite PCR e sequenziamento diretto. Da questo screening sono emerse una variante missenso, posizionata nell’esone 3 e due varianti sinonime nell’esone 11 di MSH2. L’analisi dei grandi riarrangiamenti è stata condotta tramite la tecnica MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) e sono stati individuati riarrangiamenti in 4/11 pazienti. Infine dall’analisi dell’espressione proteica tramite immunoistochimica è stata evidenziata un’alterazione dell’espressione di MSH2 in 4/11 pazienti.
Il secondo obiettivo di questa tesi è stato quello di valutare mutazioni e grandi riarrangiamenti germinali del gene MSH2 in pazienti con storia familiare di tumore della mammella e/o dell’ovaio e storia personale di tumore mammario e del colon-retto e/o dell’endometrio e/o altri tumori, risultati wild type per i geni BRCA1 e BRCA2. Questi pazienti hanno un fenotipo simile a quello della sindrome di Lynch di tipo II, che talvolta comprende anche carcinomi mammari. Sono state selezionati 11 pazienti sulla base dell’analisi dell’albero genealogico ed è stata condotta l’analisi mutazionale dell’intera sequenza codificante e delle giunzioni introni-esoni del gene MSH2 e l’analisi dei grandi riarrangiamenti tramite MLPA. Dall’analisi mutazionale è stata identificata un’unica mutazione non senso in MSH2 che porta alla produzione di una proteina tronca. L’analisi dei riarrangiamenti non ha evidenziato amplificazioni o delezioni in nessuno dei pazienti.
Infine sono state analizzate tramite i saggi in lievito descritti precedentemente tre nuove VUS di BRCA1 identificate nei pazienti con tumore familiare della mammella e/o dell’ovaio. Sono stati prodotti vettori di espressione contenenti le VUS tramite mutagenesi sito specifica del plasmide pYES2-BRCA1 che contiene il cDNA di BRCA1. Questi vettori sono stati poi espressi nei ceppi RS112, RSY6wt e RSY6msh2∆ e sono stati valutati gli eventi di ricombinazione intra ed intercromosomica e di mutazione genica.
Sulla base dei risultati ottenuti si può quindi concludere che il lievito S. cerevisiae è un buon sistema modello per l’individuazione di nuovi partner di BRCA1 che contribuiscono all’insorgenza e alla progressione del tumore familiare della mammella e/o dell’ovaio e che il gene MSH2 sembra avere un ruolo nello sviluppo di questa neoplasia.

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