• AAV
• CCCs
• Cloro
• GABAA
• imaging in vivo
• KCC2
• microscopia a due fotoni
• NKCC1
• pH

Il Cloro è uno ione fondamentale nella fisiologia della cellula perché è alla base di molti processi tra cui la regolazione del volume cellulare e il bilancio idrosalino a livello renale. Sicuramente un ruolo molto importante svolto dal Cloro è a livello neuronale: attraverso esso si esplica, infatti, la modulazione tra i livelli di attività elettrica eccitatoria e inibitoria nei neuroni. E’ noto come alterazioni a livello di omeostasi del Cloro siano implicate in vari disturbi dello sviluppo neurologico e in gravi patologie neurofisiologiche.
Il passaggio di ioni cloruro attraverso la membrana plasmatica è regolato dal recettore per l'acido γ-amminobutirrico GABAA, un canale ionico transmembrana che, in seguito al legame con il neurotrasmettitore, si apre permettendo il flusso degli ioni Cloro e bicarbonato.
Il GABA è considerato il principale neurotrasmettitore inibitorio del SNC, ma dati in letteratura riportano di un cambiamento della sua funzione durante lo sviluppo in diverse specie. In particolare esso acquisisce carattere inibitorio solo nell’adulto perché negli stadi embrionali e nei primi giorni di vita ha funzione eccitatoria.
La spiegazione di questo cambiamento funzionale è da ricercarsi nella diversa concentrazione intracellulare dello ione cloruro che è regolata principalmente dall’attività di due cotrasportatori, NKCC1 e KCC2. NKCC1 sfrutta il gradiente del Sodio per importare Cloro all’interno della cellula, KCC2 invece lo estrude nello spazio extracellulare servendosi del gradiente del Potassio. E' stato dimostrato che l’espressione dei due trasportatori cambia durante lo sviluppo, con una maggiore espressione di NKCC1 rispetto a KCC2 nelle prime fasi che poi si modifica progressivamente fino a una inversione dei livelli di espressione dei due trasportatori nell’adulto. Quando questa transizione non avviene efficacemente, insorgono gravi disturbi dello sviluppo neurale.
Per questi motivi, la capacità di effettuare in vivo misure assolute della concentrazione del Cloro intracellulare costituirebbe un importante avanzamento nello studio di tali patologie. Sebbene lo studio delle dinamiche spazio-temporali dello ione cloruro sia di fondamentale importanza per capire la fisiologia del sistema nervoso centrale, gli studi in vivo sono tutt’ora incompleti e ostacolati dalla mancanza di metodi efficaci.
Nel 2010 è stato pubblicato su Nature Methods un lavoro nel quale viene descritto un sensore geneticamente codificato per la misurazione assoluta del Cloro e del pH per l’utilizzo nella microscopia confocale a un fotone.
Il sensore è formato da due proteine fluorescenti: una variante GFP (Green Fluorescent Protein) appositamente modificata per legare il Cloro ed essere sensibile al pH e una DsRed monomerica (proteina fluorescente rossa), unite da un linker aminoacidico; il legame del Cloro alla GFP ne induce una completa perdita di fluorescenza.
Lo scopo della mia tesi è quello di verificare la validità di utilizzo di questo sensore per fornire in vivo misure quantitative della concentrazione assoluta del Cloro e una misura assoluta di pH; per poterlo fare è però necessario dimostrare la sua applicabilità alla microscopia a due fotoni.
Il mio lavoro di tesi può essere diviso in due parti principali: caratterizzazione delle proprietà spettrali a due fotoni del sensore e trasduzione in vivo dello stesso per esperimenti di imaging.
La prima parte ha richiesto: 1) la caratterizzazione dello spettro di eccitazione a due fotoni del sensore, 2) la calibrazione del pH e 3) la calibrazione per lo ione cloruro.
Lo spettro ci ha permesso di scegliere le lunghezze d’onda da utilizzare per le successive calibrazioni; quest’ultime ci hanno permesso di ottenere una curva che mette in relazione i valori di fluorescenza misurata, con la concentrazione di Cloro e i valori del pH.
La seconda parte ha richiesto: 1) la trasduzione in corteccia di vettori virali adeno-associati contenenti la sequenza del sensore, 2) chirurgia per accesso ottico in corteccia nella regione iniettata e 3) imaging in vivo a due fotoni.