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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-09282012-103921


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
FERRARA, SILVIA
URN
etd-09282012-103921
Titolo
IMAGING A DUE FOTONI DELL'ATTIVITA' EPILETTIFORME IN VIVO
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Relatori
relatore Dott. Ratto, Gian Michele
Parole chiave
  • astrociti
  • epilessia
  • imaging a due fotoni
  • interneuroni parvalbuminergici
Data inizio appello
18/10/2012
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
18/10/2052
Riassunto
L’epilessia è una condizione patologica del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da un tipico pattern di attività elettrica di una popolazione neuronale. In generale, l’attività epilettica si manifesta come crisi generalizzate, nelle quali è coinvolta l'intera corteccia cerebrale e crisi focali, caratterizzate da un focolaio epilettogeno. Il susseguirsi di manifestazioni frequenti può evolvere nella condizione di status, che a questo punto è indipendente dalle cause del processo di ictogenesi. In questo caso si avrà la manifestazione spontanea delle crisi epilettiche con frequenza variabile. Tra il 5 e il 10% della popolazione presenta un’attività epilettiforme almeno una volta nella vita. I fattori eziologici alla base dell’epilessia sono molteplici, tuttavia una delle ipotesi più accreditate è il realizzarsi di uno “squilibrio” tra tono eccitatorio ed inibitorio. Pur essendo ben note le conseguenze dello status, ancora poco conosciuti sono i meccanismi di insorgenza sia a livello di circuiteria che a livello cellulare. L’attività epilettiforme conseguente è caratterizzata dalla presenza di tre fasi distinte: 1) fase interictale: attività neuronale ipersincrona con da frequenza stereotipata e durata variabile, 2) fase tonica: caratterizzata da desincronizzazione e da marcato incremento dell’attività neuronale e 3) fase clonica: in cui si ha un progressivo incremento della sincronia e progressiva diminuzione dei picchi di attività neuronale con una transizione verso un pattern di attività normale. La definizione di attività epilettiforme si basa sulla persenza di almeno una di queste tre fasi (in alcune patologie ne sono presenti tre). La periodicità degli eventi di attività epilettiforme non è prevedibile e gran parte delle terapie utilizzate è scarsamente efficace sia in termini di attenuazione della gravità degli eventi, sia di riduzione della ripetibilità di questi. L’epilessia, quindi, può essere definita come una famiglia di condizioni patologiche caratterizzate dallo stesso esitus con manifestazioni diverse, le quali possono essere poco o molto gravi (perdita di conoscenza, alterazione della capacità cognitiva..) anche a livello cellulare (alterazione della citoarchitettura, neurogenesi, morte neuronale...). Ma i neuroni non sembrano essere le uniche cellule interessate da questo fenomeno, è infatti noto da tempo che un’altra classe cellulare ne risente: gli astrociti, i quali mostrano astrogliosi, induzione della proliferazione, alterazione della barriera ematoencefalica... Gli astrociti sono la classe cellulare gliale predomminante nel SNC. Questi rivestono diversi ruoli critici a livello del SNC, come il trasporto di glucosio/lattato, supporto strutturale per i neuroni, mantenimento dell’omeostasi ionica extracellulare, formazione della barriera ematoencefalica. Inoltre gli astrociti sono responsabili della modulazione dell’attività elettrica neuronale in quanto direttamente coinvolti nei fenomeni di potenziamento e depotenziamento, eccitotossicità, neuromodulazione. È noto che gli astrociti formano sincizi e comunicano tra loro anche su larga scala, presentano recettori per i neurotrasmettitori e rilasciano gliotrasmettitori neuroattivi (d-serina, ATP, Glutammato, GABA). Si può quindi supporre che facciano parte di un “circuito in parallelo” rispetto a quello neuronale, con dinamiche spazio-temporali completamente diverse. Infatti non sono cellule eccitabili ma si servono di un complicato sistema di trasduzione del segnale basato su oscillazioni intracellulari di Ca2+ che si osservano sia in condizoni normali (sonno, veglia, input sensoriali,..) sia in condizioni patologiche. Per questi motivi risultano essere dei candidati interessanti per lo studio della patogenesi dell’epilessia e del controllo della sincronia neuronale. Questo lavoro di tesi si propone di dimostrare che l’attività degli astrociti varia in relazione alle modulazioni di sincronia all’interno del circuito neuronale. Per dimostrare questa ipotesi abbiamo utilizzato il topo come modello animale scegliendo la corteccia visiva primaria (V1) come soggetto di analisi. Sugli animali anestetizzati è stato possibile osservare cambiamenti dell’attività neuronale a livello di popolazione e di singola cellula su scale temporali eterogenee, nel contesto di attività spontanea, di processamento di stimoli visivi e di attività epilettiforme farmacologicamente indotta. Abbiamo impiegato tecniche di registrazione di elettrofisiologia di campo con lo scopo di valutare l’attività elettrica di una vasta popolazione di neuroni. Inoltre, utilizzando la tecnologia dell’imaging del Ca2+ a due fotoni in vivo, è possibile caratterizzare l’attività sia a livello popolazione che di singola cellula nei neuroni e negli astrociti. L’utilizo combinato di queste due tecniche permette di valutare cambiamenti del grado di sincronia e il contributo delle diverse popolazioni cellulari. Inoltre l’utilizzo di animali transgenici (GAD 67-GFP) che esprimono la proteina fluorescente verde in una sottoclasse di neuroni inibitori ci ha permesso di valutare le caratteristiche funzionali del network nelle varie condizioni sopra elencate. Risultati: 1) la frequenza di oscillazioni Ca2+ negli astrociti cambiano significativamente al variare del grado di sincronia dell’attività neuronale 2) durante l’attività interictale le cellule principali esibiscono transienti Ca2+ che precedono quelli osservati nelle cellule GAD 67-GFP 3) nella transizione dall’attività basale a quella ipersincrona gli astrociti mostrano un incremento dell’attività Ca2+ 4) durante la fase ad alta frequenza si assiste ad un incremento dell’attività degli astrociti. Considerando questi risultati si propone la prospettiva secondo la quale gli astrociti risentano dei cambiamenti della sincronia dell’attività neuronale suggerendo che questi possano interagire tramite un meccanismo di feedback con l’attività neuronale stessa.
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