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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-09282012-092954


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
DE SANTI, CHIARA
URN
etd-09282012-092954
Titolo
Ruolo dei microRNA e dei loro siti target nel Mesotelioma Pleurico Maligno
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Prof.ssa Gemignani, Federica
Parole chiave
  • miRNA
  • MPM
  • SMRP
Data inizio appello
18/10/2012
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
18/10/2052
Riassunto
Il Mesotelioma Pleurico Maligno (MPM) è un tumore raro associato principalmente ad esposizione ad amianto, caratterizzato da resistenza alle terapie convenzionali e da prognosi infausta. La diagnosi è affidata fondamentalmente a indagini di tipo radiologico e immunoistochimico, che rendono difficoltosa una diagnosi precoce. La mesotelina sierica (SMRP) è stata proposta come marcatore diagnostico per il MPM in quanto elevati livelli di questa molecola sono rilevabili in soggetti affetti da MPM. Sono stati però osservati anche individui sani con livelli di SMRP elevati: è stato dunque ipotizzato che la presenza di SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) a livello della regione 3’UTR dell’mRNA della mesotelina (MSLN) possa alterare l’affinità di legame dei microRNA, piccoli RNA che agiscono da regolatori negativi, e quindi la regolazione della traduzione del messaggero. Da un lavoro di genotipizzazione della regione 3’UTR del gene MSLN di soggetti sani ex-esposti ad amianto è emersa un’associazione significativa tra la variante A dello SNP rs1057147 G>A e livelli elevati di SMRP, mentre nessuna associazione significativa è stata osservata tra lo SNP rs57272256 C>T e SMRP.
Uno degli obiettivi della presente tesi è confermare l’associazione tra genotipo e livelli di SMRP. E’ stato dunque eseguito un protocollo di estrazione del DNA da sangue su una casistica più ampia di 344 soggetti sani ex-esposti ad amianto. I risultati della genotipizzazione, effettuata con la metodica KASPar, sono stati associati ai valori di SMRP ottenuti tramite saggi ELISA. I dati a disposizione confermano i risultati ottenuti dalla precedente analisi di associazione tra genotipo e livelli di SMRP.
Per valutare la capacità di questi SNPs di alterare la regolazione dell’mRNA del gene MSLN è stato effettuato uno studio funzionale in vitro. Il vettore pmirGLO contiene il gene reporter luciferasi, a valle del quale viene clonata la 3’UTR del gene MSLN. In seguito a mutagenesi sito-specifica si ottengono i vettori varianti a livello dei due SNPs in studio. Infine viene condotto un protocollo di trasfezione in una linea cellulare idonea e il saggio della luciferasi, in grado di stabilire se l’affinità di legame di microRNA espressi endogenamente dalle cellule risenta della presenza di una variante allelica o l’altra. I risultati ottenuti mostrano che l’allele A dello SNP rs1057147 determina una diminuzione dell’affinità di legame tra miRNA e mRNA della mesotelina e conseguentemente un’efficienza di traduzione del messaggero più elevata. Lo studio funzionale conferma dunque ciò che era stato osservato nell’analisi dell’associazione tra genotipo e livelli di SMRP.
Inoltre, al fine di indagare in maniera più dettagliata il ruolo dei microRNA nella biologia del MPM, sono stati selezionati 19 miRNA ed è stata valutata tramite Real Time PCR la loro espressione in biopsie pleuriche di soggetti affetti da MPM e soggetti di controllo. MiR-200b e miR-203 mostrano una sovra-espressione nei casi rispetto ai controlli, suggerendo un loro possibile coinvolgimento nella progressione tumorale. I risultati ottenuti andranno ulteriormente validati su una casistica più ampia.
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