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La serotonina, o 5-idrossitriptamina (5-HT), è un neurotrasmettitore sintetizzato nei neuroni serotoninergici tramite due reazioni catalitiche, la prima delle quali catalizzata dall’enzima triptofano idrossilasi 2 (Tph2).
I neuroni serotoninergici sono localizzati nel rombencefalo, dove si raggruppano a formare 9 nuclei noti come nuclei del raphe. Questi sono suddivisi in una parte rostrale ed una caudale. I neuroni della suddivisione rostrale proiettano anteriormente al sistema nervoso centrale (SNC), mentre quelli della parte caudale posteriormente verso midollo spinale e cervelletto.
La serotonina è coinvolta nello sviluppo del SNC e in numerosi processi fisiologici, quali: la regolazione dell’umore, l’attenzione, la regolazione del sonno, l’aggressività, il comportamento sessuale, le funzioni cognitive e l’appetito. Oltre a questo, la serotonina con un’azione autocrina è anche coinvolta nello sviluppo e nel mantenimento del sistema serotoninergico stesso. Alterazioni a livello del sistema serotoninergico possono quindi indurre l’insorgenza di numerosi disturbi neuropsichiatrici, quali depressione, schizofrenia, ansia e disturbi dell’umore.
I Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRIs) sono tra i farmaci più frequentemente utilizzati per il trattamento di ansia e depressione. Un farmaco appartenente a questa classe è la fluoxetina, molto utilizzato poiché considerato un antidepressivo blando, perciò somministrato anche nelle donne in stato di gravidanza. Per questo motivo, poiché è noto che la fluoxetina attraversa la barriera placentare, il feto risulta esposto al farmaco per tutta la durata della gestazione. Inoltre, dato che è possibile rilevare tracce anche nel latte materno, in caso di trattamento cronico il neonato rimane esposto al farmaco per tutto il periodo della lattazione, che coincide con il periodo di massima plasticità del sistema nervoso. Diversi studi mostrano risultati contrastanti riguardo gli effetti che la fluoxetina può avere sia per eventuali difetti morfologici subito dopo la nascita (sindrome di astinenza, problemi cardiaci, respiratori, nascita prematura), sia per difetti comportamentali nella sfera delle patologie neuropsichiatriche osservati già in fase neonatale sia successivamente durante l’adolescenza e la vita adulta. Nell’uomo si ipotizza che, in relazione a questi effetti, ci possa essere un’inclinazione al cosiddetto ‘effetto paradosso’ causato da fluoxetina, in quanto una molecola classicamente usata per trattare stati depressivi possa provocare, se assunta precocemente in periodo prenatale o postnatale precoce, uno stato ansioso e/o depressivo durante la fase adulta.
Numerosi studi hanno dimostrato la presenza di un effetto paradosso anche in modelli animali esposti alla fluoxetina durante le prime fasi postnatali, in quanto durante la vita adulta manifestano comportamenti anxiety e depressive-like. Tale effetto tuttavia sembra non verificarsi nel caso in cui l’esposizione alla fluoxetina sia limitata alla fase prenatale dello sviluppo.
Questo lavoro di Tesi si inserisce in uno studio più ampio in corso nel nostro laboratorio, mirato alla caratterizzazione dello sviluppo neuroanatomico del sistema serotoninergico e del comportamento durante la vita adulta di animali sottoposti a trattamento farmacologico con fluoxetina durante la fase gestazionale e per tutto il periodo di lattazione. In particolare, con il mio lavoro di Tesi ho indagato su un modello murino gli effetti comportamentali a lungo termine indotti da una somministrazione che mimi l’esposizione cronica a fluoxetina simile a quella che ritroviamo nelle donne in gravidanza.
In particolare, abbiamo utilizzato topi Tph2GFP, linea knock-in generata nel nostro laboratorio in cui il primo esone del gene Tph2 è stato sostituito con il gene reporter della Green Fluorescent Protein (GFP), permettendo così la visualizzazione del sistema serotoninergico senza dover far ricorso ai comuni marcatori utilizzati, come ad esempio l’immunoreattività contro la serotonina oppure il suo trasportatore SERT.
Per gli esperimenti sono state utilizzate femmine eterozigoti Tph2GFP a cui è stata somministrata fluoxetina (FLX) a partire da 7 giorni prima dell’inizio della gestazione per assicurare la presenza di una copertura farmacologica durante tutto lo sviluppo embrionale. Il trattamento con FLX si è protratto fino allo svezzamento della progenie, che nel topo corrisponde alla terza settimana di vita postnatale. In parallelo sono stati generati animali di controllo ottenuti da un coorte di femmine Tph2GFP trattate con veicolo.
Raggiunta l’età adulta (Post-Natal Day, PND 90-120) la progenie è stata divisa in 4 coorti per ciascun sesso: wild type (wt) trattati con fluoxetina, wt veicolo, Tph2GFP +/- trattati con fluoxetina e Tph2GFP +/- veicolo.
Abbiamo eseguito test comportamentali che valutassero stati depressive-like (Forced Swim Test) e anxiety-like (Elevated Plus Maze, Open Field, Light-Dark Test) per determinare se vi fossero alterazioni dovute all’esposizione a fluoxetina pre e postnatale.
L’analisi dell’Elevated Plus Maze Test, gold standard per la valutazione di comportamenti anxiety-like, ha mostrato nei trattati una riduzione statisticamente significativa sia del tempo trascorso nei bracci aperti (p-value < 0.05) che nel numero di entrate (p-value < 0.05) negli adulti di entrambi sessi, aspetti tipici del comportamento anxiety-like. Anche l’analisi dell’Open Field Test ha mostrato una riduzione significativa del tempo trascorso al centro dei maschi trattati rispetto ai veicoli (p-value < 0.0001), altra caratteristica di un comportamento anxiety-like. I risultati hanno inoltre mostrato un trend di aumento nel comportamento depressive-like, analizzato con il Forced Swim Test, nei maschi trattati; nelle femmine non è stata osservata alcuna differenza. Infine, ci siamo chiesti se questa alterazione osservata in animali a circa 3-4 mesi dal termine dell’assunzione di fluoxetina a livello pre e postnatale si mantenesse anche a distanza di un anno, quindi se questo effetto paradosso avesse una componente permanente sull’attività comportamentale dell’animale. Per fare questo abbiamo ripetuto l’Elevated Plus Maze Test in animali adulti di un anno di età, che hanno mostrato livelli di comportamento anxiety-like significativamente più elevati rispetto ai controlli (numero di entrate nei bracci aperti, p-value < 0.05).
In conclusione, l’analisi di questi test comportamentali dimostra che gli adulti esposti a fluoxetina in periodo pre e postnatale mostrano comportamenti significativamente più ansiosi rispetto alla coorte di controllo.



Serotonin, or 5-hydroxytryptamine (5-HT), is a neurotransmitter synthesized by serotonergic neurons through two catalytic reactions, the first of which catalysed by the tryptophan hydroxylase 2 enzyme (Tph2).
Serotonergic neurons are localized in the rhombencephalon, where they are clustered in 9 groups, known as raphe nuclei. These nuclei are subdivided into a rostral and a caudal part, that project anteriorly to the central nervous system (CNS) and posteriorly to spinal cord and cerebellum, respectively.
Serotonin is involved in the regulation of a wide range of physiological processes, such as mood and sleep regulation, attention, sexual behaviour, cognitive functions and appetite, as well as in controlling several developmental events of the CNS. In line, serotonin with its autocrine action is also involved in the development and maintenance of the serotonergic system itself. Importantly, alterations in the serotonergic system can induce the onset of several neuropsychiatric disorders, such as depression, schizophrenia, anxiety and mood disorders.
Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRIs) are one of the most frequently used class of drugs to treat anxiety and depression. Among SSRIs, fluoxetine is widely used since it is considered a mild antidepressant; thus, it is administered to pregnant women. As fluoxetine crosses the placental barrier, the fetus can be exposed to this drug throughout gestation. Moreover, since traces are detectable in maternal milk, in case of chronic treatment the newborn is exposed to fluoxetine during lactation. Lactation is a critical phase that corresponds to the period with the highest plasticity of the nervous system. Contrasting results have been shown as a consequence of fluoxetine treatment both on morphological defects observed immediately after birth (withdrawal syndrome, cardiac and respiratory problems, premature birth) and on behavioural defects observed starting from neonatal phase up to adulthood. In relation to these behavioural effects, in humans it has been proposed the presence of the so-called “paradoxical effect” caused by fluoxetine. Indeed, an antidepressant drug if administered during prenatal and/or early postnatal period may promote an increase of depression and anxiety during adulthood.
Many studies have also demonstrated the paradoxical effect in animal models caused by early postnatal exposure, which is manifested in elevated anxiety- and depression-like behaviour during adulthood. Nevertheless, it does not seem to occur when fluoxetine is exclusively administered prenatally.
This Thesis’ work is included into a broader study carried out in our laboratory that aims to characterize the neuroanatomical development of the serotonergic system and the behavioural outcome during adulthood following fluoxetine treatment of animals during prenatal development (whole gestation) and throughout the lactation period. In particular, with my work I investigated the long-term behavioural effects in a murine model that mimics the chronic fluoxetine exposure in pregnant women.
I took advantage of the Tph2GFP knock-in mouse line generated in our laboratory and whose genome has been modified to replace the first exon of the Tph2 gene with Green Fluorescent Protein (GFP) reporter gene, thus allowing the visualization of the serotonergic system independently of the use of immunoreactivity against 5-HT or its transporter SERT.
In my work I used Tph2GFP females administered with fluoxetine (FLX). The drug treatment started 7 days before gestation, to ensure pharmacological coverage throughout embryonic development, until pups weaning corresponding to the third postnatal week in mice. In parallel, a control cohort was generated from vehicle-treated Tph2GFP females.
After offspring reached adulthood (Post-Natal Day PND 90-120), it was divided into 4 cohorts per sex: wild-type (wt) and Tph2GFP +/- mice treated with fluoxetine, and wt and Tph2GFP +/- treated with vehicle as controls.
We performed behavioural tests to evaluate depressive- (Forced Swim Test) and anxiety-like behaviour (Elevated Plus Maze, Open Field, Light-Dark Test) to assess whether the treatment with fluoxetine was able to elicit the paradoxical effect.
The analysis of the Elevated Plus Maze Test, which represents the gold standard method for the evaluation of anxiety-like behaviour, showed for the fluoxetine-treated mice of both sexes a significant reduction in the time spent in open arms (p-value < 0.05) and in the number of entries (p-value < 0.05) as compared to vehicle treated controls, thus indicating an elevated anxiety-like behaviour as a consequence of fluoxetine treatment. The Open Field Test analysis also showed a significant reduction in the time spent in the centre of the arena by treated males compared to control (p-values < 0.0001), further confirming the presence of an increased anxiety-like behaviour. Furthermore, the results showed a trend in depressive-like behaviour with the Forced Swim Test in treated males, while no difference was observed in females. Finally, we asked whether the behavioural alteration observed in young animals 3-4 months after the end of fluoxetine intake was maintained in aged mice. To this aim, we repeated the Elevated Plus Maze Test in one-year-old animals (>11 months after the end of fluoxetine treatment), that showed significantly higher anxiety-like behaviour than control (number of open arms entries, p-value < 0.05).
In conclusion, the behavioural test analysis demonstrated that fluoxetine-exposed adults in pre and early postnatal period exhibit significantly higher anxiety-like behaviour than control cohort.