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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-09272004-170927


Tipo di tesi
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Autore
Migliarini, Sara
URN
etd-09272004-170927
Titolo
Origine Embrionale del Sistema Precerebellare nel topo (Mus musculus)
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Relatori
relatore Prof. Pasqualetti, Massimo
Parole chiave
  • fate mapping
  • oliva inferiore
  • sistema precerebellare
  • transgenesi binaria
  • Wnt1
Data inizio appello
12/10/2004
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
12/10/2044
Riassunto
Il sistema precerebellare media la maggior parte delle informazioni dirette al cervelletto ed ha un ruolo cruciale per la coordinazione dell’attività motoria. Questo sistema è costituito da sei nuclei distinti ed i più importanti sono il nucleo pontino ed il nucleo dell’oliva inferiore. Dal primo prendono origine le fibre muscoidi che sinaptano con le cellule granulari mentre dal secondo originano le fibre rampicanti che sinaptano con le cellule del Purkinjie. L’origine embrionale e le varie tappe attraverso cui si giunge alla formazione dei diversi nuclei che compongono il sistema precerebellare rappresentano importanti questioni per la conoscenza dello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). I nuclei precerebellari originano dal neuroepitelio rombencefalico dorsale, definito “rhombic lip”, e si localizzano, attraverso un processo di migrazione dorso-ventrale, nella regione ventrale del ponte e del midollo allungato.
Durante lo sviluppo del SNC l’espressione transitoria di alcuni geni crea domini molecolari che permettono di identificare distinte sottopopolazioni di precursori neuronali con un simile potenziale differenziativo. A stadi precoci di sviluppo, l’espressione del gene Wnt1 definisce un dominio molecolare lungo l’asse antero- posteriore che è ristretto alla porzione più dorsale nel tubo neurale. Alcune evidenze sperimentali hanno suggerito che nel rombencefalo questa sottopopolazione di cellule del “rhombic lip” Wnt1 positiva (Wnt1+) sia la fonte dei precursori dei nuclei precerebellari. I dati sono in accordo nello stabilire l’origine di cinque dei sei nuclei mentre ci sono contraddizioni sull’origine dei precursori dell’oliva inferiore.
Il mio lavoro di tesi si inserisce nell’ambito di questo dibattito con lo scopo di stabilire l’origine dei precursori neuronali dell’oliva inferiore e di studiare in dettaglio la sequenza temporale dello sviluppo di questo importante nucleo del sistema precerebellare.
La mia indagine ha visto il topo come modello sperimentale e l’impiego di una strategia basata sulle tecniche di ricombinazione somatica sito specifica (Cre-loxP) mediata dalla ricombinasi Cre del fago P1. Ho incrociato una linea transgenica in cui la ricombinasi è sotto il controllo trascrizionale del promotore del gene Wnt1 (Wnt1- Cre) con due diverse linee transgeniche (R26R e Hoxa2 EGFP(loxP-neo-loxP) in cui l’espressione del gene “reporter” può essere attivata costitutivamente solo in seguito ad un evento di ricombinazione mediata dalla Cre. Negli embrioni così ottenuti i neuroni derivati dai precursori Wnt1+ presentano un’espressione costitutiva del gene “reporter” ?gal o EGFP. Ho utilizzato preparati di encefalo ottenuti da embrioni
transgenici a partire da stadio 12.5dpc (days post coitum) per effettuare esperimenti di ibridazione in situ ed immunoistochimica. L’analisi condotta su sezioni coronali di encefalo ha permesso di individuare a partire dallo stadio di 12.5dpc un gruppo di neuroni positivi per l’espressione dei geni “reporter” nella regione ventrale del midollo allungato dove è presente il nucleo dell’oliva inferiore. Questa osservazione suggerisce un’origine di questo nucleo a partire dai precursori Wnt1+ del “rhombic lip”. Per verificare quest’ipotesi, in parallelo, ho effettuato esperimenti di ibridazioni in situ per il gene Brn3.2, un marcatore molecolare specifico che permette di seguire la migrazione dei neuroni che formano il nucleo olivare e di individuarne la localizzazione finale nella porzione ventrale del midollo allungato. I risultati che ho ottenuto mostrano una buona corrispondenza spaziale tra la localizzazione dei neuroni che esprimono i geni “reporter” e quelli che esprimono Brn3.2. Al momento sto mettendo a punto una tecnica di doppia marcatura per verificare la co- localizzazione dell’espressione di Brn3.2 con la ? gal a livello di singole cellule.
I dati ottenuti con il mio lavoro di tesi contribuiscono far luce sulle caratteristiche molecolari dei precursori neuronali che danno origine al nucleo dell’oliva inferiore. Inoltre, questi dati forniscono una descrizione dettagliata delle fasi precoci dello sviluppo di questo nucleo.

ABSTRACT
The precerebellar system coordinates the information from the cerebellar cortex and has a key role for motor activity.
This system is comprised of six bilaterally symmetrical pairs of neuron assemblies (nuclei), of which the most important are the pontine (PN), and the inferior olive (ION). The PN projects mossy fiber axons to cerebellar granule cells, while ION projects climbing fiber axons to cerebellar Purkinje cells. The origin and the embryonic development of these nuclei are important questions for the understanding of the development of the central nervous system (CNS). Precerebellar nuclei are generated in a specialised germinative epithelium, the rhombic lip, and undergo subsequent long distance migration, during embryogenesis, to localize themselves on the hindbrain ventral region.
The transient expression of several genes in the CNS during development, establishes a molecular pattern that leads to the identification of a subset of neuronal precursors whit similar potentiality. Early in development Wnt1 gene is expressed throughout the dorsal neural tube. Some experiments suggest that the subset of rhombic lip cells expressing Wnt1 originate the precerebellar neurons precursors.
It has been shown that the Wnt1-positive rhombic lip neuroepithelium originates to the entire population of the precerebellar nuclei, but not to the neurons of inferior olive.
I have focused my study on the origin of neuronal precursors of the inferior olive and the temporal development of this important nucleus. I have used a genetic strategy based on somatic site-specific Cre-mediated (Cre/loxP) recombination. I mated the transgenic line Wnt1/Cre, who expresses the Cre recombinase under the control of the Wnt1 gene promoter, with the transgenic reporter lines (R26R and Hoxa2EGFP(loxP-neo-loxP)) who express a reporter gene, ? -gal or EGFP, only after Cre- mediated recombination. In the obtained embryos the Wnt1+ precursors express the reporter gene in a costitutive manner. I performed in situ hybridization and immunohistochemistry experiments on coronal sections from 12.5 dpc (days post coitum) to 14.5 dpc embryonic encephalon. I have observed reporter gene expression on the ventral medulla, in the region of the inferior olive. These data suggest that inferior olive nucleus originates from Wnt1+ precursors of the rhombic lip. To verify this hypothesis I made in situ hybridization for Brn3.2, a specific marker for the olivary neurons. My data show a correspondence between the reporter gene expressing neurons and those expressing Brn3.2. I’m planning double labeling experiments to verify the single cell colocalization of Brn3.2 and ? -gal or EGFP.
With my data I’m trying to understand the neuronal precursors’ molecular features who originate inferior olivary neurons. Furthermore these data support the detailed description of olivary nucleus early developmental steps.
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