• microscopia a singola molecola
• vettori lentivirali
• sistema inducibile Tet-on
• (co)recettori neurotrofinici

Questo lavoro di tesi si inserisce in una ricerca che si propone di studiare la dinamica a singola molecola di recettori neurotrofinici ed a correlarla al loro stato di signaling. Lo studio condotto precedentemente era relativo al recettore ad attività tirosin-chinasica TrkA di ratto, a cui è stata geneticamente fusa la sequenza dell’acyl carrier protein (ACP tag), substrato di enzimi di tipo Phosphopantheteinyltransferasi (PPTasi) tramite i quali vi si può legare covalentemente qualsiasi molecola funzionalizzata con il coenzima A (CoA). Tale tecnica permette di marcare con sonde fluorescenti i recettori sulla membrana di cellule vive, e si è rivelata più versatile rispetto all’uso di (lunghi) tag classici (quali GFP, HA, FLAG), congeniali per protocolli biochimici standard.
Lo scopo di questa tesi è l’implementazione e la dimostrazione dell’efficacia dei nuovi tag corti A1 e S6 (di 12 amminoacidi) derivati dalla proteina ACP, recentemente pubblicati, per lo studio del corecettore di membrana P75NTR (P75 Neurotrophin Receptor) in un contesto cellulare integro e con la possibilità di controllare quantitativamente l’espressione ectopica della proteina ricombinante, per renderla ideale per studi a singola molecola.
Questo studio e’ stato condotto in parallelo su due linee cellulari immortalizzate che, dal punto di vista genotipico e fenotipico, sono congeniali all’analisi di fattori neurotrofici e rispettivi recettori:
• Linea SH-SY5Y, derivata da Neuroblastoma umano
• Linea PC12, derivata da Feocromocitoma di ratto (i Feocromociti hanno origine neuroectodermica)
In primo luogo, abbiamo valutato la presenza di P75NTR endogeno espresso da queste linee, sia tramite saggi biochimici (Western Blot) che di immunofluorescenza, riscontrando che entrambe esprimono, anche se in misura molto differente, la proteina di membrana di nostro interesse.
Successivamente, abbiamo analizzato nelle stesse cellule l’espressione ectopica di tre costrutti ricombinanti nei quali la sequenza di P75NTR e’ stata fusa in frame a tre diversi tag, ottenendo: 1) P75-EGFP, 2) A1-P75NTR, 3) S6-P75NTR. Mediante immunofluorescenze è stato possibile comparare la localizzazione della proteina endogena con quella dei costrutti ricombinanti, anche controllandone le colocalizzazioni con marker specifici di membrana nucleare e membrana plasmatica. I saggi sono stati effettuati su entrambe le linee cellulari e hanno rivelato che né GFP né A1 o S6 influenzano la localizzazione nativa della proteina sia in cellule differenziate (con NGF) che non. Per valutare la possibile funzionalità delle proteine ricombinanti abbiamo preso in esame una modificazione post-traduzionale, una sorta di “carta di identità” di P75NTR: la palmitoilazione, ossia l’aggiunta di un residuo di acido palmitico al dominio intracellulare di questo recettore che permette l’instaurarsi del pathway apoptotico.
I tre costrutti sono stati clonati successivamente in un vettore lentivirale di ultima generazione (“all-in-one”), poiché, sfruttando la naturale infettività del virus, risulta il miglior sistema per gene delivery all’interno di linee cellulari neuronali; mediante il metodo split-component, è stato anche possibile ricostruire la particella virale con la quale trasdurre le cellule SH-SY5Y. Infine, abbiamo implementato ed utilizzato dei sistemi di visualizzazione in cellule vive dei costrutti di interesse: Il tag GFP è visualizzato direttamente mediante microscopia confocale a fluorescenza; i tag A1 e S6 sono substrati di due diverse PPTasi, e consentono una marcatura selettiva del recettore correttamente traslocato sulla membrana cellulare con dei fluorofori molto brillanti (Quantum Dots). Questi due costrutti sono utili per analizzare, mediante microscopia TIRF in vivo, i moti diffusivi di singole molecole di recettore P75NTR localizzato sulla membrana plasmatica, anche in risposta di suoi ligandi specifici quale il pro-NGF o di ligandi di cui sembra essere corecettore, quale l’NGF.
L’ortogonalità di A1 e S6, che consente una marcatura selettiva di proteine differenti in un contesto cellulare condiviso, permetterà lo studio contemporaneo di p75NTR con recettori Trk, in modo da chiarirne l’interazione funzionale; infatti, dati bibliografici contrastanti non chiariscono del tutto determinate proprietà del corecettore, quali la base meccanicistica di tale interazione, la dinamica di for¬ma¬zio¬ne del complesso recettoriale e la trasduzione del segnale nella membrana plasmatica ed al soma della cellula neuronale.