• autoanticorpi
• autoantigeni
• autoimmunità
• linfociti B

RIASSUNTO

I linfociti B sono cellule attive nell'immunità umorale adibite alla produzione di
anticorpi diretti contro antigeni non self; queste cellule,nella fase finale del loro
processo di maturazione, si differenziano in plasmacellule, ad attiva produzione
anticorpale, e i linfociti B di memoria, che mantengono memoria immunologica
dell'antigene verso cui si è scatenata la risposta immunitaria, e sono in grado, in una
risposta secondaria,di rispondere più rapidamente.
Le malattie autoimmuni sono condizioni patologiche in cui la risposta immunitaria è
diretta contro antigeni definiti “self” ovvero verso costituenti proprie dell'organismo,
causando alterazioni sistemiche, nel caso in cui vengano coinvolti diversi organi o
apparati, o organo-specifiche, nel caso in cui sia interessato un particolare organo o
apparato.
Nelle malattie autoimmuni sistemiche possono essere presenti nel siero anticorpi
diretti contro determinanti antigenici self e in alcuni casi tali anticorpi possono essere
marker di malattia. Nell'Artrite Reumatoide si trovano ad esempio autoanticorpi anti
peptidi e proteine citrullinate (ACPA) mentre nel Lupus Eritematoso Sistemico (LES)
si ritrovano anticorpi anti-dsDNA e anticorpi anti Complement1q.
Tali anticorpi possono essere presenti costantemente durante la malattia (è il caso
degli ACPA nell'AR) oppure fluttuare in relazione alle fasi della malattia (è il caso
degli anti-dsDNA e anti-C1q nel LES): il ruolo delle plasmacellule a breve e a lunga
emivita e delle cellule B di memoria nella produzione di tali anticorpi è ancora poco
noto.
Studi preliminari eseguiti analizzando mediante ELISA ed ELISPOT la produzione di
autoanticorpi sui surnatanti di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
sottoposte a stimoli policlonali (CpG-Il2 e CpG-Pansorbin-Pokeweed Mitogen) e
non sottoposte a stimoli , suggeriscono che cellule B di memoria specifiche per gli
ACPA siano assenti nel circolo periferico dei pazienti con AR, mentre sarebbero
presenti cellule B di memoria specifiche per anti-dsDNA e anti-C1q nei pazienti con
LES.
In questo senso le due malattie autoimmuni avrebbero comportamento differente.
Oggetto della tesi di laurea è proprio analizzare il ruolo delle cellule B di memoria nella
produzione di autoanticorpi nelle malattie autoimmuni sistemiche. In particolare è
nostro interesse caratterizzare le diverse popolazioni cellulari coinvolte, la fine
specificità di tali autoanticorpi e il loro potenziale patogenetico.
Per questo progetto sono stati selezioni 10 pazienti con AR, 5 con LES e 3 controlli sani; dal sangue intero di tali pazienti sono state purificate le cellule mononucleate mediante gradiente (Histopaque 1077). Le cellule sono state messe in coltura per 15 giorni con diversi stimolati policlonali (CpG-Il2 e CpG-Pansorbin-Pokeweed Mitogen) al fine di indurre l’attivazione e il differenziamento dei precursori dei linfociti B.
Dopo il trattamento sono stati recuperati i surnatanti e testati mediante metodica ELISA per valutare la produzione di anticorpi: in particolare abbiamo utilizzato come antigeni:
- VCP per i pazienti con AR
- dsDNA, C1q, ss-DNA, ACLA per i pazienti con LES
- FLUB come antigene di controllo
In particolare per valutare il ruolo delle cellule strutturali nel differenziamento dei precursori dei linfociti B nell’AR, sono stati eseguiti esperimenti di co-coltura utilizzando sinoviociti purificati da tessuto sinoviale ottenuti da interventi di sinoviectomia artroscopica in pazienti con AR o con osteoartriti. Tali cellule sono state coltivate in vitro in presenza delle cellule mononucleate sottoposte agli stimoli sopra indicati per 15 giorni: in alcuni pozzetti sono state utilizzate transwell per impedire il diretto contatto tra le cellule.
Al termine della co-coltura sono stati raccolti i surnatanti ed è stata analizzata la produzione di autoanticorpi mediante test ELISA.
Dall’analisi dei dati ottenuti si evince che gli stimoli policlonali risultano efficaci nella riattivazione di cellule B di memoria per gli anticorpi di controllo.
Utilizzando come stimolo CpG-IL2 si ottiene una maggior riattivazione dei precursori per ACPA rispetto al B.Mem.Mix nei pazienti con AR. Con CpG-IL2 si ottiene una maggior riattivazione dei precursori per autoanticorpi caratterizzanti del LES . Con B.Mem.Mix si ottiene una maggior riattivazione dei precursori per Ab di controllo nei soggetti sani.
Un dato interessante si osserva nell’analisi dei dati dei PBMC in co-coltura: in queste condizioni la riattivazione dei precursori B è favorita dalla presenza dei sinoviociti, e non risente sensibilmente della presenza del filtro di separazione, suggerendo che il contributo di tali cellule strutturali sia mediato dal rilascio di un fattore solubile.
Dal lavoro svolto si conclude che le cellule B di memoria per autoanticorpi sono presenti nel sangue periferico di pazienti con LES e AR (sia pure con diversa frequenza) e che la produzione di autoanticorpi deriva sia dalla riattivazione di cellule B di memoria sia dal reclutamento di nuovi precursori.

RIASSUNTO IN INGLESE

B lymphocytes are cells belonging to humoral immunity actively engaged in the production of antibodies specific for foreign antigens. B cells differentiate into plasma cells, actively producing antibodies, and into memory B cells, the B cell compartment responsible for keeping track of past encounters with the antigen and for rapid production of antibodies during a second contact with the antigen.
Autoimmune diseases are characterized by an immune response directed against self antigens that causes systemic disorders when multiple organs are affected or organ-specific diseases when a single organ is affected.
In systemic autoimmune diseases autoantibodies are often detectable, that sometimes can be marker of the disease. In rheumatoid arthritis (RA) antibodies specific for citrullinated proteins/peptides (ACPA) are often present while in systemic lupus (SLE) sera antibodies specific for dsDNA or C1q are found. These antibodies may be detectable constantly during the disease course (like ACPA in RA) or rather fluctuate according to disease activity, as observed with anti-C1q and anti-DNA antibodies in SLE. The role of short or long lived plasma cells and memory B cells in the production of these autoantibodies is unknown.
Preliminary data, obtained in our lab, showed that plasmacells specific for anti-dsDNA and anti-C1q antibodies are produced by memory B cells in SLE patients after polyclonal stimulation. On the contrary, the same stimuli do not differentiate plasmacells from B memory cells in RA.
The aim of this thesis is to analyze the role of memory B cells in autoantibody production in systemic autoimmune disorders, characterizing the cells involved in such a production, the specificity and potential pathogenicity of the antibodies produced.
To such extent peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 10 RA, 5 SLE patients and 3 normal controls have been isolated by Ficoll-Histopaque gradients and stimulated with different stimuli: CpG-IL2 (CpG leading to TLR9 activation and IL2 mimicking the role of T cells in B-T cognate recognition); StaphA-pokeweed mitogen-CpG (CpG and StaphA leading to TLRs activation and PWM playing a generalized role in cell activation). After stimulation we will analyze the production of total IgG, specific autoantibodies (ACPA for RA, anti-dsDNA, anti-C1q, anti-ss-DNA, ACLA for SLE) and antibodies against recall antigens by ELISA in culture supernatants. To evaluate the role of stromal cells differentiation of B cell precursors in RA, PBMC from RA patients have been cocultured with synoviocytes (obtained from synovial tissue from osteoarthritis or RA patients undergoing synoviectomy). PBMC and synoviocytes have been cocultured in direct contact or separated by a semi permable membrane in Transwell plates, to distinguish the effect of cell-cell direct contact from the effect of soluble factors. Supernatants after coculture have been collected and tested for antibody content by ELISA.
The data obtained indicate that polyclonal stimuli efficiently activate B memory for recall antigens. CpG-IL2 is more effective in activating B memory for ACPA than B.Mem.Mix in RA and SLE. B.Mem.Mix is more effective than CpG-IL2 in activating B memory for recall antigens in normals.
As far as B cells and synoviocytes are concerned, these latter perform as stromal cells both in direct contact and in the presence of a separating membrane, suggesting that soluble factors are involved in the stimulation of B cells.
On the whole, these data suggest that B memory for autoantibodies are present in peripheral blood of RA and ASLE patients (even if at different frequency). Thus, autoantibody production may derive both from recruitment of pre B cells and from activation of B memory cells.