• decellularizzazione; decellularization

Abstract

The liver is the subject of many studies because of its key role in both endogenous and exogenous metabolism. The liver tissue and its derivates have a wide range of in-vitro applications from toxicology, pharmacological research to metabolic studies. However, in-vitro hepatocyte cultures rapidly lose their differentiated phenotype and have a low survival rate, in fact static bi-dimensional cultures (monolayer cultures) are affected by a discrepancy environmental, because hepatocytes in culture are located in a microenvironment that differs greatly from the in-vivo ambient. In fact, recent studies indicate that the maintenance of an adequately differentiated phenotype requires the presence of a number of factors such as an adhesive substrate, a three dimensional scaffold, a culture medium with several factors (growth factors, hormones, vitamins), a high cell density and the presence of other hepatic cell types. Among the various methods developed to reproduce the in-vivo ambient, engineering methods use decellularized and ri-cellularized constructs called "scaffolds", cultivated in bioreactors.
In this project, we investigated various protocols of decellularization in order to obtain decellularized pig liver matrices, and then obtained matrices are used as scaffolds for seeding hepatocytes,
The absence of cellular components in decellularized matrices is confirmed histologically by staining with hematoxylin-eosin.
The total protein content of the decellularized matrices is determined using Bradford Assay, and compared to untreated liver tissue.
Moreover, is assessed the content of a specific extracellular protein, Fibronectin, using Western Blotting.
After characterization, with swelling test and micro-CT, and after sterilization, is evaluated the cytotoxicity of decellularized liver matrices.
The aim of this thesis is to identify a good decellularization protocol using non-aggressive detergents that allow the preservation of the complex 3D architecture and the mechanical properties of the extracellular matrix (ECM). Finally, decellularized matrices will be used as scaffolds that allow the in-vitro growth cells and the formation of liver in 3D models that can be used for various applications.















Riassunto

Il fegato è oggetto di molti studi dato il suo ruolo chiave sia nel metabolismo endogeno che in quello esogeno. Il tessuto epatico ed i suoi derivati hanno un ampio spettro di applicazioni in-vitro dalla tossicologia, alla ricerca farmacologica, agli studi sul metabolismo. Tuttavia gli epatociti nelle colture in-vitro perdono rapidamente il loro fenotipo differenziato ed hanno una basso range di sopravvivenza, infatti con le classiche colture statiche bi-dimensionali (colture monostrato) gli epatociti risultano deprivati dei molteplici stimoli caratteristici del loro ambiente tridimensionale in-vivo. Inoltre, studi recenti indicano che il mantenimento di un adeguato fenotipo differenziato richiede la presenza di numerosi fattori, quali un substrato adesivo, uno scaffold tridimensionale, un mezzo di coltura con diversi fattori (fattori di crescita, ormoni, vitamine), un’alta densità cellulare e la presenza di altri tipi di cellule epatiche.
Tra i vari metodi sviluppati per rendere l’ambiente degli epatociti in-vitro quanto più simile al loro contesto in-vivo, i metodi ingegneristici utilizzano costrutti decellularizzati e ri-cellularizzati chiamati “scaffolds”, coltivati all’interno di bioreattori.
In questo progetto di tesi sono state indagate varie procedure di decellularizzazione, al fine di ottenere matrici di fegato porcino decellularizzate da utilizzare come scaffolds per la semina di epatociti.
L’assenza di componenti cellulari all’interno delle matrici decellularizzate è stata confermata istologicamente con la colorazione ematossilina-eosina. Il contenuto proteico totale delle matrici decellularizzate è stato determinato utilizzando il saggio di Bradford e comparato a quello del tessuto epatico non trattato. Inoltre al termine della procedura di decellularizzazione, mediante Western Blot, è stata valutata selettivamente la presenza di una delle proteine della matrice extracellulare, ossia la fibronectina. Dopo essere state caratterizzate, con test di swelling e micro-CT, le matrici decellularizzate sono state sterilizzate, e sottoposte a test di citotossicità.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è individuare un buon protocollo di decellularizzazione, che utilizzi detergenti non troppo aggressivi, che consentano il mantenimento dell’architettura tridimensionale e delle proprietà meccaniche della matrice extracellulare (ECM).
In ultimo le matrici decellularizzate saranno utilizzate come scaffolds che permettano la crescita cellulare in-vitro e lo sviluppo di modelli epatici in 3D che potranno essere utilizzati per svariate applicazioni.