• angiogenesi
• microRNA
• miRNA signature

I microRNA, brevi filamenti di acido ribonucleico lunghi 21-25 nucleotidi presenti in tutti gli organismi eucarioti, agiscono da silenziatori dell'espressione genica tramite un appaiamento imperfetto al 3'UTR di un mRNA bersaglio. Questo tipo di regolazione genica a livello post trascrizionale è estremamente fine e modulato, poiché i microRNA agiscono in concerto, al fine di mantenere una corretta omeostasi cellulare, in maniera combinatoria e cooperativa. A tutt'oggi si conoscono circa 500 microRNA umani che hanno un caratteristico profilo di espressione detto “miRNA signature”, specifico non solo di stadi di sviluppo e di differenziamento, ma anche di diversi tipi di tumori o di altre patologie.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di verificare se la miRNA signature può essere usata per caratterizzare la disfunzione endoteliale. Per fare questo abbiamo coltivato le cellule endoteliali umane HUVEC in presenza di concentrazioni crescenti di glucosio (range 5-40mM). Dalla curva di crescita è risultato che il glucosio riduce la proliferazione di HUVEC in maniera dose dipendente e che ad alte concentrazioni esso diventa citotossico.
L’effetto dello stress da glucosio sulle proprietà angiogenetiche è stato studiato in HUVEC esposte a 30mM di glucosio (AG30). Abbiamo visto una riduzione della capacità di formare microtubi su matrice, come pure di saldare una discontinuità in colture di HUVEC confluenti.
Per caratterizzare questo fenotipo complesso abbiamo estratto l’RNA totale da cellule di controllo e AG30. I due campioni di RNA sono stati prima marcati con fluorocromi diversi e poi ibridati insieme sul microarray miRCURY LNA Exiqon. La sovrapposizione dei segnali di ibridazione ottenuti ha messo in evidenza la sovraespressione di 13 miRNA e la sottoespressione di 3, suggerendo che i microRNA sono dei sensori in grado di misurare lo stress da glucosio nelle HUVEC. L’identificazione delle potenziali proteine target dei miRNA overespressi è stata fatta mediante software specifici, mentre la validazione sarà oggetto di studi futuri.
Attualmente stiamo verificando se i miRNA trovati sotto o sovraespressi sono specifici dello stress da glucosio. Per far questo abbiamo preso in esame lo stress infiammatorio che nelle HUVEC può essere indotto dopo un’esposizione di 24 ore a lipoproteine a bassa densità (low density lipoprotein, LDL) ossidate alla concentrazione di 200μg/ml. Il fenotipo ottenuto è molto simile a quello indotto da stress da glucosio: ridotta capacità di migrazione e di angiogenesi. L’analisi del microarray è attualmente in corso.
Dal confronto tra la miRNA signature che otterremo dopo trattamento con LDL ossidate e quella ottenuta dopo trattamento con glucosio si potrà capire se i due tipi di stress, che inducono però un fenotipo simile nelle cellule endoteliali, sono di fatto distinguibili l’uno dall’altro, gettando così le basi per uno studio sistematico delle proteine sotto il controllo dei microRNA e coinvolte nella risposta allo stress.