• A549
• HMVEC-d
• Proliferazione
• TKI
• Angiogenesi
• EGFR

Introduzione. Le tirosin-chinasi sono enzimi che regolano processi cellulari, quali la proliferazione e la differenziazione cellulare, e possono essere coinvolti nel processo di oncogenesi poich¨¨ catalizzano la fosforilazione dei residui di tirosina di alcuni recettori cellulari, tra cui EGFR, VEGFR-1 e -2. EGFR ¨¨ un recettore cellulare transmembrana, la cui sovraespressione ¨¨ presente in numerose forme tumorali, quali il carcinoma non a piccole cellule del polmone (NSCLC ¨C non small cell lung cancer). Le molecole inibitrici le tirosin-chinasi (TKI) risultano, quindi, avere un ruolo promettente nel trattamento del NSCLC, in quanto determinano l¡¯inibizione della trasmissione del segnale mitogeno attraverso EGFR, impedendo la fosforilazione dei residui di tirosina associati al recettore. L¡¯interesse della odierna ricerca oncologica si ¨¨ pertanto rivolto alla sintesi di nuove piccole molecole inibenti le TK associate ai diversi recettori dei fattori di crescita. In particolare, i laboratori della Facolt¨¤ di Chimica Farmaceutica dell¡¯Universit¨¤ di Pisa hanno recentemente intrapreso la sintesi di circa 40 nuovi composti appartenenti alle TKI indicati, provvisoriamente, con la sigla TK seguita da un numero progressivo. Studi preliminari di inibizione enzimatica in vitro della TK associata a EGFR, hanno permesso di selezionare 5 composti particolarmente promettenti: TK3, TK24, TK29, TK30 e TK32.
Obiettivi dello studio. Obiettivo primario del presente studio ¨¨ quello di effettuare uno screening di efficacia farmacologica in vitro delle 5 molecole sintetizzate sia su cellule tumorali polmonari umane (A549), esprimenti il recettore EGFR, che su cellule endoteliali microvascolari umane (HMVEC-d), nell¡¯intento di valutarne una possibile attivit¨¤ antitumorale e anti-angiogenica. Obiettivo secondario dello studio ¨¨ quello di approfondire anche i meccanismi di azione delle molecole che hanno dimostrato una efficacia farmacologica significativa nei test di citotossicit¨¤.
Metodi. Le analisi di screening effettuate comprendono sia test di proliferazione che di determinazione e quantificazione dei processi apoptotici. Per saggiare gli effetti farmacologici tempo e dose dipendente dei composti TK3, TK24, TK29, TK30 e TK32, sono stati utilizzati modelli sperimentali in vitro di proliferazione cellulare bidimensionale su cellule tumorali A549 trattate per 24 e 72 ore alle concentrazioni di 50¦ÌM, 10¦ÌM, 1¦ÌM, 100nM e 10nM e su cellule endoteliali HMVEC-d alle concentrazioni di 1¦ÌM, 100nM, 10nM, 1nM e 0.1nM. L¡¯apoptosi ¨¨ stata al momento effettuata sulle cellule tumorali di polmone A549 trattate per 72 ore alle concentrazioni di 50¦ÌM, 30¦ÌM, 10¦ÌM, 5¦ÌM e 1¦ÌM. In entrambi i tipi di esperimento ¨¨ stato utilizzato anche un controllo positivo rappresentato da Gefitinib (inibitore selettivo di TK associata a EGFR attualmente in fase di registrazione nei tumori polmonari).
Risultati. Tra i farmaci testati, TK3 ha suscitato particolare interesse. Infatti, questo nuovo composto ha inibito in modo significativo la proliferazione cellulare di A549 e di HMVEC-d rispetto al controllo (trattato con il solo veicolo); la concentrazione inibente il 50% della proliferazione (IC50) di TK3 ¨¨ risultata infatti essere di 34.15¡À8.9 ¦ÌM (media¡ÀDS) sulla linea tumorale A549 e di 2.08¡À0.77 nM sulla linea endoteliale dopo sole 24 ore di trattamento, mentre dopo 72 ore di trattamento la IC50 ¨¨ risultata essere ulteriormente ridotta a 5.20¡À0.73 ¦ÌM per la linea tumorale A549 e a 0.40¡À0.22 nM per la linea endoteliale, a dimostrazione di una tempo-dipendenza. I valori sperimentali di TK3 sono stati quindi confrontati con quelli ottenuti con gefitinib, dimostrando una maggiore efficacia del composto in studio. Inoltre TK3 allo stesso intervallo di concentrazione ha dimostrato propriet¨¤ pro-apoptotiche superiori agli altri composti in studio ed allo stesso gefitinib.
Conclusioni. Dopo l¡¯iniziale attivit¨¤ di screening, sulla base dei risultati sperimentali ottenuti, ¨¨ stato possibile individuare fra i numerosi composti inizialmente testati, una molecola con promettenti propriet¨¤ anti-proliferative e pro-apoptotiche, sia su cellule tumorali che endoteliali, concentrazione e tempo-dipendenti. Le future prospettive saranno rivolte ad indagare il probabile meccanismo d¡¯azione di TK3 sia sulle cellule tumorali che endoteliali (ad esempio la possibile inibizione anche della TK associata al VEGFR-2) attraverso l¡¯analisi della via di trasduzione del segnale mitogeno (es. fosforilazione di MAPK) e apoptotico (es. fosforilazione Akt).