• microRNA
• miR-100
• miR-125b
• LRF
• MEF
• senescenza
• proliferazione

La senescenza replicativa è un destino a cui vanno incontro spontaneamente fibroblasti primari di mammifero in coltura perché esposti a stimoli mitogenici prolungati che attivano la trascrizione dei geni p19ARF e p16 del locus INK4A. Un gene che controlla l’espressione di p19ARF è il fattore di trascrizione LRF (leukemia/leucocytosis related factor) Da studi preliminari è stato visto che il 3’ UTR del messaggero del gene LRF possiede molti siti di legame per diverse famiglie di microRNA, piccoli frammenti di RNA non codificante che regolano i livelli dei loro targets attraverso l’inibizione della traduzione del messaggero. Fra questi abbiamo scelto i microRNA miR-100 e miR-125b. Lo scopo di questa tesi è stato quello di verificare se i miR-100 e miR-125b controllano l’espressione di LRF in fibroblasti embrionali di topo (MEF).
Per fare questo s cellule HEK 293T sono state cotrasfettate con il plasmide esprimente miR-100 o miR-125b assieme al plasmide contenente il 3’ UTR di LRF clonato a valle della sequenza che codifica per la eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein). Attraverso questo test di validazione eterologa, si è visto che i due microRNA controllano l’espressione di LRF a livello post-trascizionale.
Il passo successivo è stato quello di trasfettare cellule MEF (Mouse Embryo Fibroblasts) a passaggi precoci con miR-100 o con miR-125b maturi per caratterizzare gli effetti molecolari della sovra-espressione nelle MEF di questi due microRNA. La proteina LRF viene ridotta in risposta alla sovra-espressione dei due microRNA, mentre i livelli del messaggero restano costanti; questo prova che i miRNA suddetti riducono l’espressione di LRF a livello post-trascizionale, e non al livello trascrizionale.
Sono stati inoltre valutati i livelli del messaggero e della proteina p19ARF e di altri marcatori di senescenza quali p21, E2F1 e p16.
In risposta alla riduzione della proteina LRF indotta dalla sovra-espressione di miR-100 o di miR-125b, si osserva un aumento di circa 3 volte dell’attivazione trascrizionale di p19ARF, e conseguente aumento della proteina p19ARF. L’ attivazione dell’espressione di p19ARF correla con un aumento della proteina p21, un inibitore delle cicline. Inoltre si osserva una diminuzione dei livelli del fattore E2F1 (fattore centrale nella progressione del ciclo cellulare), mentre i livelli di p16, un altro inibitore delle cicline, restano costanti.
Siccome la senescenza dipende dall’attivazione dell’asse p19ARF-p21, le è stata misurata la percentuale di cellule senescenti.
Nonostante l’induzione dell’asse p19ARF-p21 le cellule trasfettate con miR-100 e miR-125b non vanno incontro a senescenza, anzi proliferano più delle MEF di controllo Questi risultati sono almeno in parte in conflitto con quelli ottenuti con il miR-20, la cui sovra-espressione nelle MEF riduce l’espressione di LRF ed anticipa l’insorgenza della senescenza.
In conclusione, l’inibizione dei livelli di LRF con miRNA appartenenti a famiglie diverse non è sufficiente per indirizzare le cellule verso un destino comune. La complessità delle azioni regolatorie mediate dai microRNA sta probabilmente nella diversità dei targets, la cui modulazione porta a risposte cellulari diverse per ogni microRNA preso in considerazione.