• Anandamide Idrolasi
• cellule del Sertoli
• endocannabinoidi
• faah

Gli endocannabinoidi sono una classe di mediatori lipidici, isolati e studiati nel corso degli ultimi decenni, coinvolti in diversi processi fisiologici, fra cui quelli riproduttivi. Essi, insieme ai recettori e alle proteine coinvolte nel loro trasporto e metabolismo, costituiscono il cosiddetto sistema endocannabinoide.
Le cellule somatiche del tubulo seminifero, dette cellule del Sertoli, direttamente coinvolte nella regolazione della spermatogenesi, presentano un sistema endocannabinoide completo e funzionale. E’ stato dimostrato inoltre che alti livelli endogeni di un endocannabinoide chiamato anadammide (arachidonoiletanolammina, AEA) possono innescare un processo di morte apoptotica nelle cellule del Sertoli, attraverso un meccanismo attivato del legame dell’AEA con il recettore vanilloide TRPV1, ed inibito dall’interazione con il recettore cannabico CB2.
L’ormone follicolo stimolante (FSH) agisce sulle stesse cellule stimolandone la proliferazione durante i periodi prenatale e perinatale, e può favorire la trascrizione e la sintesi proteica dell’anandamide idrolasi (Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH), l’enzima responsabile della degradazione dell’anandamide in acido arachidonico e etanolammina, con l’inizio della pubertà: ciò si traduce in una riduzione dell’apoptosi indotta da AEA. L’FSH può attivare la FAAH attraverso due diverse vie di segnalazione che prevedono rispettivamente il coinvolgimento della fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) e della Protein Chinasi A (PKA). In particolare, l’attività di PI3K induce un aumento dell’espressione del citocromo P450 aromatasi (ARO), che ha la funzione di convertire, in maniera irreversibile, gli androgeni in estrogeni e suoi derivati, fondamentali per la sopravvivenza delle cellule germinali. La via ARO-mediata produce un incremento della FAAH sia a livello trascrizionale che traduzionale attraverso la produzione di 17β-estradiolo (E2). L’azione dell’E2 si esplica grazie alla sua interazione con recettori nucleari specifici per gli estrogeni, ERα e ERβ, che operano come fattori di trascrizione ligando-dipendenti, interagendo con dei siti responsivi agli estrogeni (ERE) presenti sulla sequenza promotrice del gene bersaglio.
Il nostro lavoro è stato volto a individuare gli elementi genici presenti sul promotore del gene faah coinvolti nella risposta al 17β-estradiolo. Trattando direttamente con E2 colture primarie di cellule del Sertoli estratte da topi prepubere è stato riscontrato un aumento dose-dipendente dell’espressione del gene faah. L’analisi bioinformatica della sequenza del promotore ha permesso di identificare nella regione compresa tra -542 bp e +221 bp tre siti responsivi agli estrogeni denominati rispettivamente ERE1 (-433/-420), ERE2 (-170/-160) e ERE3 (-90/-78). Tale regione, denominata FAAH-542/+221, è stata clonata all’interno del vettore plasmidico pGL3, ed utilizzata per trasfettare le cellule in coltura. La somministrazione di E2 ha indotto nelle cellule trasfettate un significativo aumento dell’attività del promotore, misurata attraverso Luciferase-Assay.
La specificità d’interazione del complesso E2-ER con i siti ERE è stata accertata tramite l’utilizzo di composti noti come classici agonisti ed antagonisti del recettore per l’estradiolo: il tamoxifen, il fulvestran e l’epiestradiolo. Da tali trattamenti risulta che le sostanze, usate da sole ed in combinazione con l’E2 non producono alcuna variazione sull’attività del promotore. La reale funzionalità delle sequenze identificate in silico come ERE, è stata dimostrata attraverso la creazione di specifici mutanti per la regione promotrice FAAH-542/+221. La totale rimozione della porzione del promotore contenente le tre sequenze ERE (FAAH-39/+221) non ha prodotto alcun aumento dell’attività in seguito a stimolazione con E2.
Attraverso i mutanti specifici è stato possibile identificare il coinvolgimento di ciascuno dei tre siti nella modulazione dell’attività del promotore. Dal nostro studio è emerso che i siti ERE2 e ERE3 risultano indispensabili per la regolazione del gene faah da parte dell’E2, mentre il ruolo di ERE1 potrebbe essere quello di potenziare l’attivazione del promotore.
Tali risultati indicano che l’induzione della trascrizione del gene faah da parte degli estrogeni potrebbe assicurare all’interno di queste cellule il mantenimento di un basso livello di AEA, tramite la sua degradazione. Questa azione d potrebbe essere fisiologicamente rilevante per la sopravvivenza delle cellule del Sertoli di topo prepubere e, di conseguenza, per una stabilizzazione del numero di cellule che determina un’efficiente capacità spermatogenica nell’adulto.