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L’Aldoso Reduttasi (ALR 2) è un’ossidoreduttasi NADPH-dipendente che catalizza la riduzione in alcoli di un’ampia varietà di composti carbonilici, come aldosi e aldeidi. Si tratta di una proteina monomerica citosolica composta da 315 residui amminoacidi ed è pressoché ubiquitaria. Nella cosiddetta via dei polioli, l’enzima permette la conversione del glucosio in sorbitolo, poi trasformato in fruttosio dalla Sorbitolo Deidrogenasi. In condizioni patologiche di iperglicemia, quando la via glicolitica è saturata, il glucosio può entrare in parte nella via dei polioli (che normalmente funziona solo in minima parte) causando sbilanci metabolici che si traducono in danni tissutali in vari distretti, come cristallino, retina, glomeruli renali e nervi periferici, bersagli tipici delle complicanze del diabete. Benché le funzioni fisiologiche dell'ALR 2 non siano state ancora del tutto chiarite, la presenza dell'enzima in distretti anatomici differenti e la sua distribuzione non uniforme sembrano avvalorare l'ipotesi che l'enzima svolga ruoli differenti a seconda del tipo cellulare preso in considerazione. Recentemente è stato dimostrato che l’ALR2 è coinvolto anche in alcuni meccanismi di signaling cellulare. L’ALR 2, pur non essendo una metallo-proteina, è particolarmente sensibile allo ione rameico che è in grado, se presente in concentrazioni paragonabili a quelle dell’enzima, di complessarsi alla proteina determinando la formazione di un ponte disolfuro intramolecolare tra la Cys298 e la Cys303 con conseguente inattivazione dell’enzima. Studi svolti nel laboratorio in cui si è svolta la presente tesi hanno evidenziato che il rame legato ad ALR2 mantiene la capacità di catalizzare processi ossidativi a carico di composti tiolici, comportandosi di fatto da “tiolo ossidasi”.
Scopo della tesi è la caratterizzazione dell’attività tiolo ossidasica acquisita da ALR2 in seguito alla modifica da rame.
ALR2 è stata purificata ad omogeneità elettroforetica da cristallini di vitello, attraverso una procedura composta da 3 passaggi cromatografici: scambio ionico su DEAE cellulosa, affinità su Matrex Orange e gel filtrazione su Sephadex G75. Per la caratterizzazione dell’attività tiolo ossidasica di ALR2 modificata da rame sono stati utilizzati come substrati di tale attività due tioli fisiologici, che sono risultati particolarmente suscettibili di ossidazione ad opera del rame complessato all’enzima, la cisteina e la cisteinilglicina. Nelle diverse condizioni sperimentali adottate, la capacità tiolo ossidasica di ALR2 modificata da rame è paragonata alla capacità ossidante del cloruro rameico.