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Gli aptameri sono piccole molecole oligonucleotidiche sintetiche a DNA o ad RNA in grado di legare differenti classi di molecole bersaglio con elevata affinità e selettività. La possibilità degli aptameri di riuscire a discriminare anche tra target strettamente correlati tra loro è dovuta alla loro capacità di ripiegarsi in una struttura tridimensionale complessa con un motivo strutturale ben definito e geometricamente compatibile con la superficie della molecola bersaglio, che diviene così parte intrinseca della struttura dell’acido nucleico. Si tratta di molecole con proprietà anticorpo simile ma che rispetto a questi ultimi presentano caratteristiche vantaggiose come una limitata immunogenicità, la possibilità di essere sintetizzati per via chimica, una maggior resistenza alla denaturazione e la capacità di rinaturazione spontanea. Queste caratteristiche, combinate con la specificità di riconoscimento molecolare e con la facilità di selezione in vitro, rende gli aptameri molecole molto interessanti da impiegare come strumenti per varie applicazioni diagnostiche ed analitiche.
Gli aptameri sono generalmente ottenuti attraverso un processo di selezione in vitro definito SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment), una tecnica che permette di isolare oligonucleotidi funzionali a partire da una vasta libreria di oligonucleotidi sintetici a DNA o ad RNA. Ciascun membro di questa libreria è un oligomero lineare costituito da una regione centrale casuale fiancheggiata da due regioni definite che rappresentano i siti di legame per i primer. La metodica di selezione prevede cicli ripetuti di due processi: la selezione che permette di separare le sequenze leganti il bersaglio da quelle che non lo legano; l’amplificazione delle specie selezionate tramite la reazione a catena della polimerasi, PCR.
Nonostante le enormi aspettative, ancora oggi gli aptameri non sono riusciti a sostituire gli anticorpi che costituiscono tuttora i principali strumenti per il riconoscimento molecolare.
I principali svantaggi che ne hanno impedito la rapida diffusione sono rappresentati dal convenzionale metodo di selezione che risulta essere piuttosto laborioso e richiede un’alta intensità di lavoro e di tempo ma anche dalla necessità di attuare procedure di rilevazione/quantificazione che consentano di valutare il processo di selezione ed il suo avanzamento. Negli anni è quindi emersa la richiesta di sviluppare dispositivi miniaturizzati ed automatizzati in grado di svolgere tutte le diverse funzioni di laboratorio normalmente ottenibili tramite l’impiego di differenti strumenti macroscopici. Tali dispositivi prendono il nome di “Lab-on-chip” (LOC) ed il loro sviluppo è stato possibile anche grazie ai recenti progressi nell’ambito della microfluidica. I vantaggi ottenibili dall’utilizzo del Lab-on-chip sono principalmente legati alla miniaturizzazione e sono molteplici. Si ha infatti una riduzione dei costi, una maggiore sensibilità ed efficienza delle operazioni svolte, una maggior rapidità ed un utilizzo limitato di campioni e di reagenti.
In questo lavoro di tesi, svolto nel Laboratorio di Tecnologie Genomiche presso l’istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, si è cercato in particolare di determinare le condizioni migliori delle diverse fasi della procedura SELEX al fine di sviluppare un chip miniaturizzato ed automatizzato per la selezione di aptameri a ssDNA, adattabile a differenti target molecolari. Le prove sperimentali che sono state effettuate hanno quindi avuto lo scopo di ottimizzare le diverse fasi di selezione/amplificazione e renderle adattabili alle caratteristiche del dispositivo.
Il chip in progettazione può essere graficamente rappresentato come uno schema costituito da 3 blocchi che hanno scopi ben precisi e diversi tra loro. Uno di questi è destinato alla reazione di PCR (amplificazione che produce dsDNA), uno alla separazione degli strand (per ottenere le sequenze ssDNA) ed un altro all’interazione con il target molecolare.
Per lo svolgimento di questo lavoro di tesi sono stati utilizzati una collezione combinatoria di partenza e due primer “reverse” e “forward” già sintetizzati per via chimica, mediante un sintetizzatore. La libreria iniziale è composta da oligomeri di 76 bp che presentano una regione centrale casuale di 34 nucleotidi affiancata da due regioni ben definite di 20 e 22 nucleotidi, che rappresentano i siti di appaiamento per i due inneschi necessari per la reazione di amplificazione mediante la tecnica della “Polymerase Chain Reaction”. Sono stati inoltre utilizzati due diversi cloni selettivi per la fosfotirosina grazie ai quali è stata valutata l’efficienza della terza camera del chip miniaturizzato.
In un primo momento si è quindi proceduto a determinare le condizioni migliori per permettere di eseguire la reazione di PCR a livello del chip: la temperatura di denaturazione “standard” della reazione di PCR rappresenta un parametro critico per il sistema miniaturizzato. A tal proposito sono state svolte delle prove in parallelo per valutare la possibilità di utilizzare una temperatura di denaturazione inferiore ai 94°C nella reazione di PCR e per confermare allo stesso tempo la sua validità.
Le condizioni analizzate hanno mostrato una buona attività di amplificazione nonostante la diminuzione della temperatura di denaturazione.
Dal momento che la reazione di PCR fornisce molecole a DNA a doppio filamento sono state successivamente effettuate ulteriori prove nell’ottica di ottimizzare la procedura di separazione degli strand e al fine di definire le condizioni ideali per lo svolgimento nella seconda camera del chip. A tal proposito è stato inizialmente utilizzato il metodo streptavidina-biotina poiché ritenuto più idoneo all’applicazione sul dispositivo ma, viste le problematiche presentate, si è avuta la necessità di effettuare ulteriori prove di separazione basate sulla digestione enzimatica del filamento di non interesse (antisenso) ad opera della Lambda Esonucleasi che ha mostrato un’ottima attività catalitica consentendo l’ottenimento del ssDNA desiderato.
Successivamente si è proceduto a verificare la funzionalità dell’ultima camera del chip, destinata all’interazione delle sequenze selezionate in seguito alla separazione degli strand con il bersaglio scelto e, a questo scopo sono stati impiegati due diversi cloni selettivi per la fosfotirosina, la cui capacità di legame con il target è stata confrontata con quella di sequenze casuali non selettive.
Per valutare la resa dei diversi processi (PCR, ottenimento del ssDNA, eluizione delle sequenze che hanno legato la molecola bersaglio) si è presentata la necessità di realizzare studi aggiuntivi volti a definire un opportuno metodo di monitoraggio per l’intero sistema di selezione a livello del chip. In particolar modo è stata valutata la possibilità di impiegare Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride (RubiPy) come intercalante e quindi la sua capacità di evidenziare e quantificare la presenza di DNA.
In questo lavoro di tesi sono state quindi affrontate, con un approccio multidisciplinare e flessibile, le problematiche relative alla conciliazione delle classiche tecniche di biologia molecolare, che necessitano di strumentazioni dedicate e che hanno protocolli ben definiti, con dispositivi miniaturizzati i quali presentano vincoli costruttivi e condizioni operative particolari.