• Solid Phase Peptide Synthesis
• Radiolabeling
• Microfluidics
• Click Chemistry
• Aprotinin
• Amyloidosis

Le amiloidosi sono un insieme eterogeneo di malattie, localizzate o sistemiche, acquisite o ereditarie, caratterizzate dall’accumulo di depositi proteici, chiamati amiloidi, nei tessuti dell’organismo. Le manifestazioni cliniche di questa patologia variano a seconda dell’organo colpito e del precursore proteico implicato nella formazione degli amiloidi.
Il coinvolgimento cardiaco si riscontra nelle tre maggiori tipologie di amiloidosi sistemiche: amiloidosi da catene leggere monoclonali (AL), amiloidosi ereditaria da transtiretina (ATTR) e l’amiloidosi senile (SSA). Questa complicanza ha un impatto molto sfavorevole nella prognosi, portando alla morte la maggior parte dei pazienti nel giro di pochi mesi dalla diagnosi.
La valutazione clinica dell’Amiloidosi cardiaca (AC) risulta difficile perché i sintomi sono comuni ad altre forme di cardiopatia e si palesano solo nelle fasi più avanzate della malattia. Nel tentativo di rendere la diagnosi sempre più precoce e accurata sono state prese in considerazione molte metodiche diagnostiche strumentali. Tra queste, le metodiche diagnostiche medico- nucleare (PET, SPECT) forniscono uno strumento con notevoli potenzialità per superare i limiti diagnostici attuali e possibilmente identificare e quantificare precocemente i depositi amiloidi. Questo è possibile grazie all’utilizzo di molecole radiomarcate, che forniscono segnali rilevabili al di là della barriera fisica costituita dal corpo umano e consentono di individuare l’infiltrazione miocardica in maniera non invasiva e potenzialmente prima della comparsa di evidenze cliniche.
Negli anni molti sforzi sono stati rivolti alla ricerca di marcatori molecolari in grado di rilevare con alta sensibilità e specificità i depositi amiloidi cardiaci, ma, ad oggi, ancora nessun tracciante è stato approvato per l’indagine di AC.
Tra le molecole che hanno mostrato un elevata affinità per gli amiloidi cardiaci, spicca l’Aprotinina, marcata con 99mTc per SPECT imaging. Si tratta di una proteina ad attività anti serin-proteasica, le cui proprietà chimiche e strutturali la rendono un ligando selettivo per le fibrille, sia nelle amiloidosi AL che ATTR.
Lo scopo della tesi è quello di sviluppare un piccolo peptide (25-mer), costruito sulla base della struttura dell’Aprotinina, opportunamente funzionalizzato in modo da renderlo marcabile con fluoro-18, per valutarne in prospettiva l'impiego nella diagnosi dell’Amiloidosi cardiaca mediamte tomografia ad emissione di positroni (PET).
Questa tecnica di imaging consente di ottenere informazioni quantitative dello stato di malattia ed immagini e con una miglior risoluzione spaziale rispetto alla SPECT, soprattutto grazie alle caratteristiche fisiche del radionuclide 18F, che si vuole impiegare.
L'attività sperimentale condotta nel lavoro di tesi parte quindi dalla progettazione e de-novo sintesi di una prima sequenza amminoacidica, basata sul frammento ciclico dell’Aprotinina 30-51aa, legato ad una Lisina-azide, tramite una sequenza di tre Glicine. In seguito è stata progettata e sintetizzata una seconda sequenza, simile alla prima, in cui è stata leggermente modificata la sequenza in vista di una migliore stabilità e gestibilità in fase di ciclizzazione.
La sintesi peptidica è stata effettuata in fase solida, utilizzando la chimica Fmoc e amminoacidi opportunamente protetti. La prima sequenza è stata sintetizzata usando un approccio manuale, la seconda avvalendosi di un sintetizzatore automatico a microonde.
La funzionalizzazione dei peptidi con un'azide ha permesso l'adozione di una strategia di marcatura altamente selettiva attraverso la reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare (click-chemistry) catalizzata da rame(I) con un sintone 5-[18F]-fluoro-1-pentino, preparato allo scopo. Il triazolo formatosi nella reazione di click è ottenibile con alte rese ed in tempi brevi, perfettamente adeguati alla breve emivita del fluoro-18 (109 min). Inoltre questa reazione gode di elevato grado di biortogonalità, risultando molto stabile in vivo.
La sintesi del 5-[18F]-fluoro-1-pentino è stata messa a punto impiegando una piattaforma di sintesi microfluidica, mediante sostituzione nucleofila del corrispondente tosilato.
Tutti i passaggi sintetici sono stati controllati (resa e purezza chimica/radiochimica) mediante analisi HPLC, TLC e MS. L'attività specifica del prodotto finale è stata valutata mediante HPLC impiegando il prodotto freddo (19F) preparato seguendo la stessa procedura.