• BTG2
• p53
• riduzione proliferazione
• MG-132
• Nutlin-3

I gliomi maligni sono responsabili di circa il 2% delle morti correlate al cancro. Tra questi tumori, l'astrocitoma anaplastico e il glioblastoma (GBM) sono incurabili e rappresentano i più comuni gliomi negli adulti. Tra i GBM quello primario è la forma più frequente e tra le sue peculiarità genetiche esprime p53 nella sua forma “wild-type”. Questa caratteristica rappresenta una opportunità per lo sviluppo di approcci terapeutici finalizzati a potenziare/stabilizzare l’attività di p53 e dei suoi target. Tra i vari target di p53, l’oncosoppressore BTG2, appartenente alla famiglia
BTG/tob, interagisce con molti fattori coinvolti in differenti attività cellulari ed agisce come
regolatore del ciclo cellulare inducendo il blocco della proliferazione, l'acquisizione del fenotipo senescente e talvolta l'apoptosi. Questa tesi ha avuto il duplice scopo di analizzare l’espressione e la funzione di BTG2 nei gliomi e di individuare un approccio farmacologico finalizzato a stimolare l’azione antiproliferativa di p53 e del suo target BTG2.
RISULTATI: L’analisi quantitativa dei livelli di espressione di BTG2 in campioni di GBM ed in
frammenti di cervello normale indica che questo gene ha una espressione altamente disomogenea
nei diversi campioni tumorali e che spesso i trascritti BTG2 sono più abbondanti nel tessuto
tumorale rispetto a quello normale. In colture primarie ottenute dagli stessi gliomi e in linee stabili di glioma i livelli di espressione di BTG2 calano a livelli basali. Nella linea U87MG (esprimente p53 nella sua forma “wild-type”) i livelli di espressione di BTG2 aumentano in relazione al trattamento con agenti proradicalici confermando che anche in queste cellule la sua regolazione dipende dalla attivazione di p53 in risposta al danno al DNA. Gli elevati livelli di espressione di BTG2 nei tessuti tumorali sono compatibili con la presenza di sottopopolazioni cellulari soggette a danno ossidativo, oppure in senescenza replicativa in seguito all’accorciamento dei telomeri. Il sequenziamento di BTG2 dal genoma dei tessuti tumorali non rivela mutazioni. Poichè dati di letteratura suggeriscono che BTG2 sia anche soggetto ad uno stretto controllo post-traduzionale dovuto ad una rapida degradazione ad opera del proteasoma abbiamo condotto studi di stabilità mediante la sovraespressione della chimera GFP-BTG2, che hanno rivelato che la proteina BTG2 viene immediatamente degradata nella linea U87MG. Tale degradazione è impedita dal trattamento con inibitori del proteasoma. Nonostante la sua rapidissima degradazione, la transitoria
sovraespressione di BTG2 agisce determinando una riduzione della crescita cellulare. Tale
riduzione risulta inoltre significativamente potenziata dal trattamento con inibitori del proteasoma.
Questi dati hanno suggerito di sviluppare una strategia farmacologica basata sul potenziamento dei livelli di espressione dei trascritti di BTG2 e il contemporaneo prolungamento della emivita della proteina codificata. Per potenziare i livelli di espressione di BTG2 abbiamo utilizzato l’inibitore della interazione di p53 con MDM2, Nutlin-3. Mentre abbiamo utilizzato l’inibitore del proteasoma MG132 per stabilizzare sia BTG2 che la proteina p53 stessa. Entrambi i farmaci, usati singolarmente, producono un aumento dei livelli del trascritto di BTG2, tale effetto risulta fortemente sinergico se i due farmaci vengono usati in combinazione. L’effetto sulla vitalità di diverse concentrazioni dei due farmaci ha permesso di individuare alcune combinazioni dove l’MG132, a concentrazioni di per se non citotossiche, potenzia fortemente l’effetto della Nutlin-3 somministrata a dosi inferiori alla soglia di tollerabilità stabilita in trial clinici. Il trattamento con
tale combinazione farmacologica produce un aumento del volume cellulare, un blocco dell’attività proliferativa, un aumento dell’apoptosi e della necrosi. Tuttavia il fenomeno più evidente è l’accumulo di vacuoli acidi contenenti sia materiale amorfo fortemente elettrondenso che materiale altamente eterogeneo di probabile natura autofagica. Nel loro insieme, i risultati ottenuti suggeriscono che il cotrattamento con inibitori del proteasoma a basse concentrazioni può rappresentare una opportunità per potenziare gli effetti di piccole molecole inibitrici di MDM2 e rappresentano un incentivo per future ricerche finalizzate a potenziare singolarmente e specificamente l’attività dei target di p53 oltre a p53 stessa.