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• sesquiterpene
• morte cellulare

PROPRIETA’ PRO-APOPTOTICHE DI EUPLOTINA C, UN METABOLITA
SECONDARIO ISOLATO DAL CILIATO MARINO EUPLOTES CRASSUS:
MECCANISMI MOLECOLARI.
RAZIONALE
L’apoptosi è un vero e proprio programma di morte potenzialmente presente in tutte le cellule,
codificato a livello del loro genoma, che determina l’eliminazione controllata di alcune cellule per
salvaguardare la sopravvivenza dell’organismo nel suo complesso. L’innesco del processo
apoptotico può essere mediato da numerosi stimoli, e può avvenire secondo meccanismi diversi, a
seconda del tipo di cellula coinvolta, che sembrano comunque convergere verso una sequenza di
eventi altamente conservata. La concentrazione di Ca2+ intracellulare ([Ca2+]i) sembra rivestire un
ruolo cruciale nel processo apoptotico. In particolare, la fase di innesco è seguita da una fase
esecutrice in cui la cellula va incontro a diversi cambiamenti biochimici che culminano con
l'attivazione di enzimi catabolici (proteasi e nucleasi) che tagliano proteine e DNA. In una morte
cellulare per apoptosi si devono riscontrare condensazione nucleare, frammentazione del nucleo,
taglio del DNA in frammenti internucleosomali e formazione di corpi apototici senza rottura della
membrana plasmatica. Un ruolo principale è giocato dalle caspasi (cistein-proteasi). Infatti, dopo
attivazione delle caspasi iniziatrici si attivano, con un segnale a cascata, le caspasi esecutrici che
tagliano proteine critiche per la sopravvivenza cellulare inducendo cosi la morte della cellula.
Attualmente sono stati identificati diversi meccanismi di apoptosi che possono comunicare e
interscambiare alcuni componenti e che possono o meno essere associati all'attivazione delle
caspasi.
Molti agenti farmacologici già in uso nella terapia contro i tumori ed alcuni potenziali agenti
antitumorali attualmente in fase di sperimentazione, sono composti ad azione citotossica/proapoptotica
che derivano da piante, animali, organismi marini e microrganismi. La ricerca sui
composti naturali ha dimostrato che spesso funzionano come “armi chimiche” evolute in quanto
potenti inibitori di processi cellulari nelle prede, nei predatori, nei parassiti o nei competitori degli
organismi che li producono. I sesquiterpeni, in particolare, sono una classe di molecole che hanno
dimostrato un potenziale terapeutico nella riduzione della progressione tumorale. Si tratta di
isoprenoidi a 15 atomi di carbonio presenti tipicamente nelle piante e negli organismi marini.
L’aldeide sesquiterpenica euplotina C, uno dei metaboliti secondari prodotti dal protozoo ciliato
marino Euplotes Crassus, ha una notevole attività biologica in quanto uccide i ceppi di Euplotes
non produttori di euplotine, mentre a dosi sub-letali altera il ciclo cellulare, la motilità cellulare e la
forma cellulare. Studi precedenti, condotti dal gruppo di ricerca della Prof. Bagnoli (Dip. di
Biologia-Unità di Fisiologia Generale) su cellule tumorali AtT-20 (corticotrope di topo) e PC12
(cromaffini di ratto) hanno dimostrato l’effetto citotossico dell’euplotina C a concentrazioni
micromolari e la sua capacità di indurre morte cellulare per apoptosi. In particolare, l’apoptosi si
manifesta dopo le 6 h di trattamento. Inoltre, l’euplotina C induce un rapido e sostenuto aumento
della [Ca2+]i attraverso la deplezione di Ca2+ dai compartimenti del reticolo endoplasmatico (RER).
In particolare, l’euplotina C determina l’apertura dei canali al Ca2+ rianodinici presenti sulla
membrana der RER.
Questa tesi ha lo scopo di indagare ulteriormente i meccanismi molecolari che mediano l’effetto
apoptotico dell’euplotina C. Infatti, la valutazione delle potenzialità terapeutiche di un composto
naturale si basa, oltre che sullo studio del tipo di attività biologica, anche sulla comprensione dei
meccanismi biochimici che ne regolano l’azione. In questa ottica, la conoscenza dei meccanismi di
traduzione del segnale apoptotico mediato dall’euplotina C nelle cellule tumorali rappresenta un
passaggio essenziale.
RISULTATI
Nelle cellule PC12, è stato valutato l’effetto dell’euplotina C su i) una serie di fattori pro- e anti-
apoptotici tipicamente coinvolti nei processi di morte cellulare e, ii) su enzimi effettori quali le
calpaine (proteasi calcio-dipendenti) e le caspasi. Infine è stato studiato anche l’effetto
dell’euplotina C sull’induzione di stress ossidativo.
Misure di vitalità cellulare (test MTT) dopo applicazione di euplotina C in presenza o meno di
rianodina, uno specifico bloccante dei canali rianodinici, hanno dimostrato che la rianodina è in
grado di inibire, almeno in parte, l’azione citotossica del sesquiterpene, suggerendo l’importanza
fondamentale del Ca2+ come mediatore dell’apoptosi indotta da euplotina C. La deplezione di Ca2+
dal RER può indurre il cosiddetto “stress del reticolo”. La proteina chaperone Bip/GRP78 è
comunemente usata come indicatore di stress. Mediante tecnica di Western blot abbiamo dimostrato
che l’espressione di tale proteina aumenta in presenza di euplotina C a partire da 1 h di trattamento
fino ad un massimo dopo 6 h. Oltre al RER anche altri organuli intracellulari, tra cui i mitocondri,
costituiscono importanti sedi di integrazione tra la fase di induzione apoptotica e l’attivazione delle
caspasi (fase di esecuzione). Fattori pro-apoptotici come Bax, una volta traslocati dal citosol alla
membrana mitocondriale determinano la formazione di megapori inducendo la caduta del
potenziale mitocondriale e la fuoriuscita di fattori necessari per il prosieguo della cascata
apoptotica, tra cui il citocromo c. Al contrario fattori anti-apoptotici come BCl-2 garantiscono
l’integrità della membrana mitocondriale e sono in grado di sequestrare e silenziare fattori proapoptotici.
Mediante PCR semiquantitativa abbiamo dimostrato che l’espressione dell’mRNA di
Bax aumenta dopo 1-3 h di trattamento con euplotina C, per poi tornare a valori basali dopo 6 h dal
trattamento. Al contrario l’espressione dell’mRNA di BCl-2 diminuisce progressivamente a partire
da 1 h di trattamento con euplotina C. Questi risultati sono stati confermati in maniera speculare
dallo studio dell’espressione delle proteine Bax e Bcl-2 tramite Western blot. Con la stessa tecnica
abbiamo dimostrato che l’espressione del citocromo c aumenta dopo applicazione di euplotina C a
partire da 1 h di trattamento. In particolare, l’incremento del citocromo c si verifica in estratti
citosolici privi di mitocondri suggerendo che tale proteina viene indotta dall’euplotina C a
traslocare dal lume mitocondriale al citosol.
Abbiamo quindi spostato la nostra attenzione sulla fase di esecuzione del programma apoptotico,
studiando l’effetto di euplotina C su alcuni importanti effettori implicati nel processo di morte
cellulare. La procaspasi-12, è una proteina localizzata sul versante citoplasmatico della membrana
del RER che in seguito ad un prolungato “stress del reticolo” ed alla mobilitazione del Ca2+ dal
RER viene attivata a caspasi-12. Esperimenti di Western blot hanno dimostrato che solo tempi di
incubazione prolungati delle cellule con l’euplotina C (6 h) causano una diminuzione dei livelli di
procaspasi-12, suggerendo che l’attivazione della caspasi-12 interviene solo in seguito ad una
esposizione prolungata delle cellule all’euplotina C. L’attività della caspasi-3, una delle principali
caspasi esecutrici del programma di morte cellulare, spesso utilizzata come marker apoptotico, è
stata determinata mediante un test colorimetrico condotto su cellule trattate a diversi tempi con
l’euplotina C. Dopo 3-6 h di trattamento con l’euplotina C si verifica un incremento dell’attività
della caspasi-3, suggerendo il coinvolgimento di tale enzima nel processo apoptotico indotto da
euplotina C. Anche le proteasi della famiglia delle calpaine possono essere implicate nella fase di
esecuzione dell’apoptosi e possono essere attivate in seguito ad un aumento massivo della [Ca2+]i.
Nel nostro studio, l’espressione dell’mRNA della calpaina e la sua l’attivita enzimatica sono stata
valutate in cellule trattate con euplotina C mediante PCR semiquantitativa e dosaggio enzimatico
fluorescente. L’espressione dell’mRNA della calpaina aumenta dopo 1-3 h di trattamento con
euplotina C, per poi tornare a valori basali dopo 6 h dal trattamento. Anche l’attività della calpaina
risulta incrementata dopo 1 h di applicazione di euplotina C per poi tornare a livelli basali dopo 3-6
di trattamento. Per sostenere l’importanza dell’attività della calpaina nel processo di apoptosi
indotto dall’euplotina C, la vitalità delle cellule è stata misurata con il test MTT in assenza o in
presenza di uno specifico inibitore delle calpaine. I risultati dimostrano che l’applicazione
dell’inibitore delle calpaine induce morte cellulare in assenza di euplotina C suggerendo che le
calpaine attivate in condizioni di Ca2+ basale hanno un ruolo importante per la sopravvivenza
cellulare. D’altra parte, l’applicazione dell’inibitore delle calpaine sembra potenziare l’efficacia
citotossica dell’euplotina C. Per spiegare questo risultato possiamo speculare che l’attivazione delle
calpaine da parte di euplotina C possa svolgere un ruolo di feedback negativo che limita l’azione
citotossica del sesquiterpene. Tuttavia, la verifica di questa ipotesi ha bisogno di ulteriore
approfondimento.
Lo stress ossidativo è un processo che avviene all’interno delle cellule in seguito ad una massiccia
produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e può essere indotto da insulti tossici subiti dalla
cellula. Lo stress ossidativo può essere un’importante componente dei meccanismi apoptotici.
Esperimenti condotti tramite test MTT dopo applicazione di euplotina C in presenza o meno di uno
specifico inibitore di ROS hanno dimostrato che gli effetti citotossici di euplotina C sono ridotti,
almeno in parte, in presenza dell’inibitore, suggerendo che la generazione di ROS è un meccanismo
del processo apoptotico indotto dall’euplotina C. Tale ipotesi è stata verificata ulteriormente
misurando la generazione di ROS con un dosaggio fluorescente. Infatti, l’applicazione
dell’euplotina C causa un rapido aumento della generazione di ROS; tale aumento è lineare e
progressivo, con un massimo dopo 3 h dall’applicazione di euplotina C. Al fine di stabilire se Ca2+
de generazione di ROS agiscono in concomitanza od in maniera indipendente nel processo
apoptotico indotto da euplotina C, sono state effettuate misure della [Ca2+]i con tecnica
spettrofluorimetrica. In particolare, abbiamo dimostrato che l’incremento della [Ca2+]i indotta da
euplotina C è significativamente ridotta in presenza dell’inibitore di ROS. Questi risultati
suggeriscono che la deplezione del Ca2+ dal RER indotta da euplotina C è in qualche modo facilitata
dall’induzione di stress ossidativo all’interno delle cellule, suggerendo una sorta di interazione tra
vie di trasduzione Ca2+-dipendenti e stress ossidativo.