• 16S rRNA
• 18S rRNA
• ciliati
• FISH
• Simbiosi
• stagni costieri salmastri

Il lavoro ha come obiettivo l’identificazione e la caratterizzazione morfologica e molecolare di protozoi ciliati mesopsammici di uno specifico ambiente salmastro confinato e dei loro eventuali batteri simbionti. L’attenzione è stata focalizzata sui ciliati quantitativamente dominanti nell’ambiente e che, ad uno screening preliminare, risultavano associati a batteri ecto- od endosimbionti. Tali caratterizzazioni rappresentano un punto di partenza indispensabile per possibili studi futuri di tipo ecologico volti a determinare la variabilità spaziale e temporale delle associazioni simbiotiche all’interno della comunità in esame.
Sono stati effettuati tentativi di coltivabilità su ciascuna specie di ciliati presa in esame, ed ove possibile sono state allestite colture monoclonali. La caratterizzazione morfologica è stata effettuata mediante osservazioni in vivo (binoculare, D.I.C.), colorazioni cellulari (Feulgen, impregnazione argentica). osservazione al S.E.M. La microscopia a trasmissione (T.E.M.) ha consentito una descrizione ultrastrutturale dei batteri simbionti.
Come marcatori molecolari sono stati impiegati il 18S rDNA per i ciliati ospiti ed il 16S rDNA per i batteri simbionti, caratterizzati tramite PCR e sequenziamento diretto (ove possibile) o PCR, clonaggio e sequenziamento dei cloni rappresentativi. Sulla base delle sequenze del 16S rRNA desunte, sono state fatte sintetizzare specifiche sonde oligonucleotidiche marcate con fluorocromi al fine di poter associare con certezza, tramite ibridazione in situ, una sequenza di 16S rRNA ad uno specifico batterio simbionte.
Sei tipi di batteri simbionti sono stati ritrovati in quattro diversi ciliati: Euplotes parawoodruffi (Spirotrichea, Hypotrichia), che ne contiene due, Frontonia salmastra (Oligohymenophorea, Peniculia), anch’esso contenente due simbionti, Sonderia cfr. vorax (Plagiopylea, Plagiopylida), Pseudomicrothorax dubius (Nassophorea, Microthoracida). Sono state messe a punto specifiche tecniche per il mantenimento di colture monoclonali di F. salmastra e di popolazioni di Sonderia cfr. vorax e P. dubius. Gli organismi sono stati caratterizzati morfologicamente e molecolarmente. La scarsità di letteratura e l’ambiguità di interpretazione di alcune caratteristiche morfologiche non ha consentito di poter giungere in tutti i casi alla determinazione della specie. Sono state ottenute le sequenze del 16S rDNA del simbionte principale di E. parawoodruffi, un β-proteobatterio vicino al gen. Polynucleobacter, del simbionte di F. salmastra., un β-proteobatterio vicino al gen. Holospora, e del simbionte di P. dubius., un β-proteobatterio vicino al gen. Rickettsia; tali risultati sono stati confermati da esperimenti di ibridazione in situ utilizzando sonde genere-specifiche. La caratterizzazione dei simbionti di Sonderia sp. e del simbionte secondario di E. parawoodruffi, appartenenti alla cl. Gammaproteobacteria, è tuttora in corso.