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Lo sviluppo di sistemi alternativi per il rilascio mirato di farmaci nell’organismo costituisce il centro di numerosi studi nel settore biomedico. La possibilità di utilizzare un sistema basato su nanoparticelle magnetiche (MNP), per trasportare biomolecole o farmaci in specifici distretti presenta grosse potenzialità in ambito terapeutico. Un’importante applicazione del “drug delivery” in biomedicina è rappresentata dal “targeting” oculare e, in particolare , della camera posteriore dell’occhio che rappresenta un target terapeutico fondamentale per curare o limitare i danni di gravi malattie dell’occhio. Nel presente lavoro di tesi ci proponiamo di sviluppare un sistema basato su nanoparticelle magnetiche per il rilascio controllato di molecole bioattive e/o di farmaci in specifici distretti oculari. Come prova di fattibilità, il rilascio di molecole da MNP è stato studiato, scegliendo come “reporter” il VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), avendo a disposizione un modello di zebrafish caratterizzato dall’espressione costitutiva della GFP (green fluorescent protein) nelle cellule endoteliali sotto sotto il controllo del promotore del recettore di tipo 2 del VEGF (kdrl).
In particolare, la nostra attenzione si è concentrata sullo studio della isoforma VEGF165 umana, che è stata prodotta come proteina di fusione con la GST (glutatione S-transferasi) in E. coli (rVEGF). La presenza della GST come “tag” ha facilitato la purificazione della proteina, che è stata usata per la valutazione dell’effetto neo-angiogenico in embrioni di zebrafish. Per verificare che la proteina prodotta fosse funzionale sono state effettuate microiniezioni di rVEGF nel sacco vitellino di embrioni di zebrafish (24 hpf, hours post fertilization) concentrando la nostra attenzione sullo sviluppo della regione delle vene sub-intestinali (SIV) che presenta un pattern di vasi sanguigni ben definito nelle prime fasi di sviluppo e ben documentato in letteratura. Abbiamo così dimostrato che l’rVEGF induce una risposta pro-angiogenica delle cellule endoteliali della regione SIV di zebrafish. Alla luce di ciò le nanoparticelle magnetiche sono state funzionalizzate con il rVEGF, mettendo a punto un protocollo sperimentale che consentisse di preservare la biofunzionalità della proteina. Le nanoparticelle funzionalizzate con rVEGF sono state quindi microiniettate in embrioni di zebrafish per verificare il mantenimento della bio-attività del rVEGF. Anche in questo caso è stata osservata una modificazione del profilo angiogenico paragonabile a quello ottenuto con il solo VEGF, in relazione alle dosi iniettate.
Dopo aver dimostrato la funzionalità delle MNP-rVEGF abbiamo, infine, studiato la distribuzione e la localizzazione delle MNP-rVEGF nell’occhio di zebrafish tramite microiniezioni intraoculari. Le MNP-rVEGF iniettate intravitrealmente nella camera anteriore dell’occhio sono in grado di localizzarsi nella parte posteriore dell’occhio e in particolare nello strato RPE/coroide e mesenchima perioculare.
I risultati ottenuti hanno dimostrato per la prima volta il targeting specifico di MNP funzionalizzate con una molecola bioattiva nella coroide nella camera posteriore dell’occhio, ponendo le basi per l’ottimizzazione di sistemi di rilascio specifico, sia di fattori pro- o anti-angiogenici sia di farmaci mirati, da sfruttare come strumento per “drug-delivery” intraoculare a scopo terapeutico.