• differentiation
• enthesis
• mesenchymal stem cells
• scaffold
• tendon

Il tendine è un tessuto fibroso che collega le estremità dei muscoli alle ossa. Il suo compito è quello di trasmettere la forza esercitata dai muscoli alle strutture ai quali sono connessi. Questa struttura è dotata di una elevata resistenza ma di una bassa elasticità, questo è dovuto alla composizione della matrice extracellulare. I numerosi stimoli e sforzi a cui questa struttura viene sottoposta possono portare a lacerazioni e rottura. La lesione tendinea, ove possibile, è trattata medicalmente, tuttavia in alcuni casi l’intervento chirurgico è indispensabile. I trattamenti medici comportano l’immobilizzazione del’arto ed un periodo di riposo che va dalle 4 alle 8 settimane; sebbene i tempi di recupero siano brevi e il rischio di infezione sia basso, il tendine non riacquista le sue proprietà ottimali. Vista l’importanza delle zone colpite, questo comporta un notevole deficit per il paziente.
L’intervento chirurgico, associato ad una terapia fisioterapica, ha il vantaggio di riportare il tendine vicino alle condizioni originarie, ma con lunghi tempi di recupero. Come soluzione a queste problematiche, inizialmente si è pensato di procedere attraverso il trapianto autologo di cellule staminali mesenchimali (MSC) e di cellule staminali progenitrici tendinee (TSPC) nella zona interessata dalla lesione. Il vantaggio dei trapianti autologhi è che non vi è rigetto, in quanto le cellule sono prelevate direttamente dal paziente. Questo tipo di trapianti però non consente né un differenziamento controllato né un’azione mirata in una determinata area. I recenti passi avanti nel campo della bioingegneria hanno reso possibile l’utilizzo di impianti tendinei. Sebbene le protesi utilizzate riescano a restituire parziale funzionalità al legamento leso, non sono in grado di conferire la stessa resistenza di un tendine umano. Trapianti di tendine da donatori sono riportati in letteratura, ma un aspetto critico di tale approccio è la difficoltà di fissare il tendine all’osso, a causa della notevole differenza strutturale tra i due tessuti. Per superare questo problema, la creazione in vitro di un’entesi potrebbe rappresentare un punto di svolta per il trattamento chirurgico delle lesioni tendinee, consentendo un perfetto inserimento del tendine sull’osso. L’entesi è infatti un breve segmento che rappresenta la parte di contatto tra tendine ed osso. Grazie alla sua particolare struttura, caratterizzata da strati di tessuto a diversa elasticità, agisce da "ammortizzatore" tra la rigida struttura ossea e quella flessibile del tendine. Il corretto sviluppo dell’entesi è quindi un traguardo fondamentale per garantire una corretta riparazione del sito danneggiato, che non pregiudichi le fondamentali caratteristiche strutturali.
Lo scopo del presente progetto di tesi è stato quello di ottenere scaffolds biocompatibili e biodegradabili, in grado di direzionare il differenziamento di cellule mesenchimali staminali sia in tenociti che in osteoblasti, attraverso le loro proprietà fisiche e meccaniche.
La valutazione della biocompatibilità e delle capacità di supporto al differenziamento a tenociti e osteoblasti è stata eseguita utilizzando cellule mesenchimali stromali (MSC) umane derivate dal midollo osseo.
Per la creazione degli scaffold, sono stati presi in considerazione diversi materiali, sia di origine naturale (Gelatina o Gelatina metacrilata) che sintetica (l’acido poli(lattico-co-glicolico) o PLGA, PLLA, Policaprolattone o PCL). Tali scaffold sono stati quindi testati per valutarne la biocompatibilità tramite saggi di vitalità evidenziando come il PLGA presenti le migliori caratteristiche di supporto all’adesione e la crescita delle MSC. Successivamente, la capacità del PLGA di supportare il differenziamento delle MSC è stata valutata tramite analisi realt-time PCR. In particolare, le cellule adese al PLGA sono state trattare con specifici mezzi per indurre il differenziamento a osteoblasti o tenociti, ed è stata valutata la capacità del polimero di modulare l’espressione genica di marker staminali (NANOG), di proliferazione cellulare (MKI67), di differenziamento ad osso (RUNX2) e a tendine (COL1A1 e SCXA). I risultati hanno dimostrato la capacità del PLGA di supportare non solo la proliferazione ma anche il differenziamento delle MSC.
Sulla base dei risultati, sono stati applicati nuovi metodi di produzione utilizzando sia PLGA che il PCL. Il PCL ha mostrato capacità simili al PLGA di supportare l’adesione delle MSC e che in letteratura è stato già utilizzato per supportare il differenziamento ad osso.
Il supporto per il differenziamento a tenociti è stato ottenuto mediante Electrospinning, una tecnologia di fabbricazione che permette di ottenere film polimerici cosiddetti “tessuto-non-tessuto” partendo da soluzioni polimeriche. Il polimero utilizzato per questa applicazione è il PLGA. L’elettrofilatura è stata condotta sia su un supporto planare che su di un collettore rotante per ottenere film con fibre allineate in grado di incrementare il differenziamento a tenociti. Il supporto per il differenziamento a osteociti è stato invece ottenuto mediante la Stampa 3D a filamento fuso, utilizzando come polimero il PCL. Le MSC di origine commerciale sono state quindi differenziate in assenza e in presenza dei supporti, per garantire un controllo positivo tra il differenziamento indotto dallo scaffold e quello indotto dai mezzi di differenziamento.
Per ottenere gli osteoblasti è stato utilizzato un mezzo commerciale; per quanto riguarda i tenociti, non essendo presente in commercio un mezzo già pronto, è stato utilizzato un mezzo addizionato di diversi fattori, secondo quanto riportato in letteratura. Colorazioni istologiche dei campioni hanno dimostrato la capacità di entrambi gli scaffolds, PCL3D e PLGA elettrofilato, di supportare rispettivamente il differenziamento ad osteoblasti e tenociti indotto dall’applicazione dei mezzi differenzianti. Dai risultati emerge anche che il PCL3D è in grado di indurre di per se il differenziamento delle MSC ad osteoblasti. Contrariamente, il PLGA non ha indotto cambiamenti visibili nel differenziamento delle MSC a tenociti dopo 14 o 21 giorni supportando la necessità di applicare fattori esterni (mezzi differenzianti o stretching) per l’induzione del differenziamento.
Per sviluppare il supporto dell’entesi sono state unite queste due tecniche: è stato elettrofilando prima il PLGA su di un collettore rotante ed in seguito, stampando il PCL sull’elettrofilato. In questo modo si ottiene un supporto che presenta due substrati che dovranno supportare il differenziamento a tenociti o a osteoblasti, ed un’interfaccia che dovrà favorire un differenziamento intermedio con conseguente sviluppo dell’entesi.
In conclusione, nel presente lavoro di tesi è stato osservato come la natura, la struttura e, di conseguenza, le proprietà meccaniche e fisiche dei supporti possono avere una grande influenza sul differenziamento delle MSC. Sebbene ulteriori studi siano necessari, il presente studio rappresenta un punto di partenza per lo sviluppo in vitro di una struttura complessa come l’entesi. Inoltre ulteriori studi saranno necessari per capire come l’applicazione di streatching o altri fattori possa modulare il differenziamento a tenociti promuovendo la corretta formazione dell’entesi.