• cumarine
• saggi enzimatici
• vinil epossidi
• sonde molecolari
• glicoconiugati

Il metabolismo cellulare è finemente regolato dalla presenza di enzimi, la cui disregolazione può portare a stati patologici o segnalarne la presenza. La valutazione dell’attività enzimatica è di conseguenza un campo molto attivo nell’ambito della biofisica, della biochimica e delle biotecnologie, ed è ampiamente studiata sia a fini diagnostici, sia per scopi terapeutici. La diagnosi di molti disordini lisosomiali, causati dalla ridotta o assente attività di specifici enzimi, è abitualmente effettuata in ambito clinico tramite saggi enzimatici su biopsie o prelievi di sangue, mentre l’aumentata attività di alcuni enzimi, in particolar modo nei processi tumorali, è alla base del meccanismo di funzionamento di molte tecniche di “medicina di precisione”.
Ad oggi sono disponibili saggi quantitativi per molti enzimi implicati in importanti patologie, con particolare riferimento agli enzimi implicati nei disordini lisosomiali. Grazie alla semplicità di messa a punto, riproducibilità e sensibilità, l’utilizzo di substrati fluorogenici per la determinazione dell’attività enzimatica è considerato come uno degli approcci più affidabili per utilizzo clinico ed in ambito di ricerca. La maggior parte dei saggi disponibili è però finalizzata ad un impiego in cuvetta, e non è facilmente traslabile in vitro a causa principalmente delle caratteristiche fotofisiche dei substrati impiegati. I substrati fluorogenici comunemente utilizzati, infatti, sono spesso ottimizzati per un utilizzo su lisati cellulari e non sono banalmente traslabili ad un impiego in vitro (o in prospettiva in vivo). A titolo di esempio, i saggi che fanno uso di sistemi a base cumarinica come substrati prevedono uno step di basificazione a pH non compatibili con una quantificazione in cellule viventi.
Questo fatto pone severe limitazioni alla possibilità di avere accesso a mappe di attività enzimatica spazialmente o temporalmente risolte sfruttando tecniche di microscopia ormai diffuse nell’ambito delle scienze della vita. Queste limitazioni possono quindi rendere più difficoltosa la comprensione di meccanismi e dinamiche più sottili e transienti rispetto a quanto ottenibile dalla semplice analisi di lisati cellulari. In prospettiva, questa limitazione impedisce di mettere a punto tecniche di diagnostica diretta potenzialmente in grado di individuare stati patologici a livello della singola cellula o a livello subcellulare (diagnostica di precisione).
In questo ambito lo sviluppo di nuovi sensori fluorescenti in grado di segnalare con alta precisione spazio-temporale eventuali disregolazioni, anche transienti, dell’attività enzimatica, potrebbe consentire di valutare in maniera più accurata sia lo stato metabolico di singole cellule che l’effetto terapeutico in tecniche di drug screening.
Questo lavoro di tesi si colloca nell’ambito di una linea di ricerca presente da anni nel nostro laboratorio e riguardante la sintesi di glicoconiugati mediante l’utilizzo di innovativi glicosil donatori, ed ha come fine la sintesi e validazione di sonde fluorescenti solvatocromiche, compatibili con tecniche di microscopia a fluorescenza, per la quantificazione a pH fisiologico dell’attività enzimatica. Il lavoro di tesi si è incentrato sullo sviluppo di sonde per la quantificazione dell’attività enzimatica di α- e β- glucosidasi, in considerazione del notevole interesse di questi enzimi sia nel campo dei disordini lisosomiali (sindrome di Gaucher),sia in ambito tumorale. Il progetto sperimentale ha previsto la sintesi di un’unità fluorogenica a base cumarinica caratterizzata da elevata intensità di emissione a pH neutro-acidi tipici dell’ambiente citoplasmatico e lisosomiale, la sua coniugazione ad una unità glicosidica sensibile all’azione della gluocosidasi e la valutazione delle proprietà del nuovo glicoconiugato.