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Le paraplegie spastiche ereditarie (HSP) sono un gruppo di disordini neurologici ereditari, clinicamente e geneticamente eterogenei, la cui manifestazione predominante è il deficit motorio causato dalla progressiva spasticità e debolezza bilaterale degli arti inferiori
Tra le numerose forme di HSP, la SPG31 e la SPG72 sono associate rispettivamente a mutazioni a carico dei geni REEP1 e REEP2. Le proteine da essi codificate svolgono numerose funzioni all’interno della cellula, dalla morfogenesi delle membrane, alla corretta distribuzione di organelli e molecole, al metabolismo lipidico e purinico. La molteplicità delle funzioni svolte rende ancora più difficile la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della patologia, che si stanno però sempre più direzionando verso le alterazioni a carico di reticolo endoplasmatico e mitocondrio e del dialogo tra questi due organelli, in cui le proteine REEP sono implicate.
La SPG31 costituisce il 4-6% dei casi di HSP a trasmissione autosomica dominante: ad oggi sono note più di 40 mutazioni di REEP1 associate a SPG31; di recente scoperta sono le 3 mutazioni nel gene REEP2 associate a SPG72 con modelli di ereditarietà mista.
Il progetto di ricerca, in cui si inserisce il mio lavoro di tesi, nasce da una collaborazione tra la professoressa Michela Ori e il professor F.M Santorelli dell’IRCCS Stella Maris di Calambrone (Pisa) ed ha come obiettivo lo studio funzionale dei geni reep1 e reep2 in embrioni di Danio rerio (zebrafish) per meglio comprendere il loro coinvolgimento nelle patologie sopra menzionate.
A questo proposito, data l’assenza di informazioni in letteratura, ho proceduto innanzitutto alla determinazione del pattern di espressione spazio-temporale di questi due geni in embrioni di zebrafish a vari stadi di sviluppo, tramite ibridazione in situ whole-mount.
Ho poi condotto esperimenti di perdita di funzione del gene reep1, tramite microiniezioni di morpholino in embrioni di zebrafish allo stadio di una cellula. Ho inizialmente utilizzato uno splicing morpholino diretto contro la giunzione esone 2-introne 2 del gene, potenzialmente in grado di promuovere la rimozione dell’esone 2 tramite l’alterazione del processo di splicing. Data la scarsa efficienza dello splicing morpholino utilizzato, confermata da analisi dei trascritti provenienti da embrioni iniettati con differenti dosaggi dell’oligonucleotide, abbiamo deciso di sfruttare un secondo morpholino, capace di provocare il blocco della traduzione della proteina Reep1. Al fine di analizzare il ruolo di questo gene durante lo sviluppo embrionale, soprattutto a livello neurale, ho infine condotto esperimenti di immunoistochimica whole-mount, utilizzando anticorpi diretti contro proteine, quali tubulina e znp1, su morfanti a vari stadi di sviluppo. Inoltre, dato sono presenti studi in letteratura che riportano alterazioni a carico del cervelletto in pazienti affetti da SPG31; ho effettuato esperimenti di ibridazione in situ whole-mount utilizzando una sonda diretta contro il trascritto di aldoca (fruttosio bisfosfato aldolasi Ca), che permette una marcatura specifica delle cellule del Purkinje, al fine di valutare eventuali anomalie a livello del cervelletto dei morfanti.
In ultima analisi, test comportamentali sono stati utilizzati per la valutazione del fenotipo motorio degli stessi morfanti in rapporto ad embrioni wild type.
Nonostante la presenza di differenze neuroanatomiche con l’uomo, zebrafish è un ottimo strumento per lo studio dei meccanismi molecolari alla base di questi disordini e, grazie anche alla possibilità di effettuare test comportamentali, oltre che screening di molecole e composti con possibile effetto terapeutico, rappresenta un importate tassello tra gli studi in vitro e i modelli murini per le HSP.