• apoptosi irreversibile
• glioblastoma multiforme (GBM)
• MDM2
• p53

Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore cerebrale più aggressivo ed invasivo e con un elevatissimo tasso di mortalità, per cui rimane ad oggi una delle più importanti sfide in ambito oncologico. I pazienti affetti da glioblastoma hanno in media una sopravvivenza di 1-2 anni dalla diagnosi e comunemente, anche se trattati chirurgicamente e farmacologicamente, muoiono per l’insorgenza di recidive. La comparsa di recidive frequenti è correlata alla resistenza di tale tumore alla radioterapia e ai classici farmaci chemioterapici utilizzati, tra cui principalmente l’agente alchilante, Temozolomide. Per tali motivi, la ricerca si sta indirizzando fortemente negli ultimi anni verso lo studio dei meccanismi molecolari alla base della farmaco-resistenza di questo tumore al fine di ottimizzare lo sviluppo di innovative strategie terapeutiche.
Un ruolo fondamentale nei meccanismi di apoptosi cellulare è svolto dalla proteina p53; oltre a promuovere l’espressione di specifici geni chiave nel controllo della proliferazione cellulare, la proteina p53 interviene nel ciclo cellulare e nella riparazione di danno al DNA ed è capace di innescare il processo apoptotico in seguito a danno genotossico. Nel GBM sono stati osservati sia una mutazione del gene codificante per p53, con conseguente perdita funzionale, sia una sovra-espressione della proteina Murine Double Minute-2 (MDM2), il principale regolatore negativo della stessa proteina p53. Molecole inibitrici dell’interazione p53/MDM2 rappresentano al momento un approccio farmacologico per il trattamento di questo tumore cerebrale. Inoltre, recenti scoperte nel campo della biologia molecolare hanno dimostrato che l'aberrazione di diverse vie di segnale è coinvolta nella patogenesi dei gliomi maligni, e hanno permesso di identificare nuovi bersagli per nuovi approcci terapeutici. Poiché queste vie di segnale intracellulare non funzionanti sono il punto di convergenza per diversi stimoli, la terapia multi-target sta diventando il modo preferito per lo sviluppo di terapie innovative e più efficienti. Oltre alla terapia multi-target, un approccio farmacologico efficace per il trattamento del glioblastoma è l’utilizzo di molecole capaci di legare proteine target in maniera irreversibile, tra cui ad esempio gli inibitori dei recettori tirosin chinasici di ultima generazione. È stato ipotizzato infatti che una molecola reversibile potrebbe non essere sufficiente per sostenere un effetto terapeutico nel tempo, favorendo l'attivazione di vie di segnale alternative che sfuggono l’azione dei farmaci e provocano fenomeni di farmaco-resistenza. Recentemente è stato suggerito, infatti, che gli effetti benefici di farmaci indirizzati verso altri target biologici e comunemente in uso per la cura di determinati stati patologici, possono essere attribuiti, più che all’alta affinità di legame del farmaco, alla lunga durata del complesso farmaco-bersaglio, parametro noto come “Residence Time”.
Lo scopo della presente tesi è stato quello di valutare la potenziale attività anti-tumorale e caratterizzare il meccanismo d’azione, molecolare e cellulare, di una nuova molecola sintetica, EB148. Tale composto è stato sviluppato partendo dal derivato a struttura 2-fenilindol-3-ylglyoxyl-dipeptidica, EB54, che era già stato dimostrato essere in grado di riattivare la funzionalità di p53, tramite la dissociazione dal suo inibitore endogeno MDM2 (Murine Double Minute-2). Nelle cellule di glioblastoma umano (U87MG), tale composto è in grado di indurre blocco del ciclo cellulare ed apoptosi, portando quindi ad un blocco della vitalità/proliferazione cellulare. Partendo da EB54, il ligando irreversibile EB148 è stato sviluppato introducendo un gruppo elettrofilo in posizione 5 dell’anello indolico. Lo scopo dell’introduzione del sostituente isotiocianato è stato infatti quello di ottenere un ligando egualmente affine a MDM2, ma con un aumentato “residence time” al target biologico, in modo da prolungare e migliorare l’attività anti-proliferativa.
Come primo step, è stata valutata la capacità della nuova molecola di dissociare MDM2 da p53 e il tempo di legame dei due ligandi al target MDM2. Il composto EB148 è risultato capace di dissociare efficacemente il complesso p53/MDM2, legandosi a MDM2 con un’affinità pari a 6.81 ± 0.79 nM, valore comparabile con quello dell’analogo reversibile (IC50=11.65 ± 0.49 nM). Per verificare il meccanismo d’azione covalente del composto, inoltre, sono stati svolti studi in cinetica di dissociazione da MDM2. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, in presenza di EB148, l’inibizione del complesso p53/MDM2 viene mantenuta costante anche dopo diluizione del campione. Al contrario, la diluizione dei campioni ha invece diminuito progressivamente il legame a MDM2 di EB54, confermando la natura reversibile dell’interazione con MDM2.
La riattivazione della funzionalità di p53 da parte di EB148 è stata verificata valutando sia i livelli trascrizionali dei geni target di p53, sia i livelli di espressione della proteina p53 stessa. I risultati hanno confermato che EB54 induce un aumento significativo di mRNA dei geni target di p53 e un significativo accumulo di tale proteina, ma con effetti che non persistono dopo rimozione del ligando. Al contrario, EB148 è in grado di attivare p53 in modo sostenuto nel tempo, mantenendo livelli di proteina significativamente più alti rispetto al controllo anche dopo rimozione del ligando. Successivamente, è stato valutato il coinvolgimento delle MAPK (Mitogen-activated protein kinase) ERK1/2 negli effetti mediati dai composti. Il modello cinetico di attivazione delle ERK è infatti il pre-requisito che regola i risultati biologici finali di queste proteine segnale. Mentre un’attivazione temporanea di queste chinasi è comunemente associata con un effetto proliferativo, la loro fosforilazione sostenuta nel tempo innesca le vie di segnale di morte cellulare. Mentre il composto reversibile non induce nessuna significativa stimolazione delle ERK1/2, EB148 induce una significativa fosforilazione delle ERK e il segnale rimane elevato fino a 8 ore di trattamento. Inoltre, anche dopo un wash-out, il composto irreversibile continua ad attivare queste chinasi. Tale segnale è risultato essere mediato da p53. Infine, i composti sono stati valutati per i loro effetti sulla proliferazione/vitalità cellulare. Entrambi i ligandi inibiscono la vitalità cellulare delle cellule U87MG con valori di IC50 paragonabili. A differenza di quanto visto con EB54, la rimozione di EB148 non ha comportato un recupero della normale crescita delle cellule rimaste, suggerendo la compromissione dei meccanismi che regolano la progressione cellulare.
I risultati, quindi, hanno dimostrato che la molecola risulta essere attiva a livello del complesso p53/MDM2 e le proprietà irreversibili di associazione possono rappresentare una strategia utile per guidare le cellule di GBM verso un’apoptosi irreversibile, superando gli effetti di durata limitata tipici dei chemioterapici classici.