• BcL2
• BIRC5
• ribozima hammerhead

Questo lavoro di tesi sperimentale è stato svolto nel Laboratorio di Tecnologie Genomiche presso l’Istituto di Fisiologia Clinica del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Pisa.
Gli minimal hammerhead ribozyme (mHHR) sono molecole oligonucleotidiche a base di RNA dotate di attività catalitica endo-ribonucleasica in grado di scindere selettivamente uno specifico bersaglio di RNA. La possibilità di sintetizzare per via chimica queste molecole consente di progettare ribozimi che siano in grado di esplicare la propria attività endonucleasica contro specifici RNA messaggeri target. Per questi motivi i HHR possono avere impiego come strumenti di knock-down genico in studi di controllo dell’espressione genica. Potenzialmente queste molecole possono avere ampie prospettive di impiego in campo terapeutico.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di applicare un metodo per la progettazione, la sintesi, la purificazione e la caratterizzazione di un ribozima in grado di bloccare due target specifici: la proteina BcL-2 (B-cell lymphoma 2) e BIRC5 (Bacuroviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5). Entrambe le proteine, pur appartenendo a famiglie diverse, svolgono la stessa funzione che è quella di regolatori dell’apoptosi cellulare.
Innanzitutto, utilizzando un sistema bioinformatico chiamato ALLADIN, è stata progettata la sequenza del ribozima e, sulla base di motivate valutazioni, è stata scelta la sequenza più appropriata per lo scopo che ci si era prefisso. Tale sequenza è stata quindi sintetizzata per via chimica, utilizzando un sintetizzatore di oligonucleotidi (sintesi mediante fosforoamiditi).
Una volta purificata la sequenza, sono stati condotti studi di cinetica, modificando di volta in volta il rapporto tra ribozima e target e anche le concentrazioni di magnesio, importante per il funzionamento del ribozima, all’interno del tampone di reazione.
Per valutare l’effetto di interazioni a lunga distanza tra le diverse porzioni che costituiscono il ribozima, è stata aggiunta una “coda” (o “tail”) , ovvero una piccola sequenza oligonucleotidica all’estremità 5’ della sequenza canonica. L’attacco al ribozima di nostro interesse è stato realizzato utilizzando uno specifico linker SMCC (succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate) che ha consentito la formazione di un legame covalente tra molecole dotate di gruppi amminici alifatici primari e gruppi tiolici. In questo modo sono stati realizzati gli extended hammerhead ribozyme (eHHR) sui quali sono stati condotti studi di cinetica, nelle stesse condizioni dei precedenti, per apprezzare la variazione di attività in presenza di ”code”. Questo approccio può essere utilizzato per modulare in modo semplice l’attività di ribozimi minimal ed extended dotati di code con diverse sequenze.
I risultati ottenuti possono fornire un contributo interessante per la progettazione di ribozimi dotati di un’apprezzabile attività catalitica alla concentrazione di ioni magnesio presente nei fluidi biologici e nel citosol, e quindi nelle condizioni in cui i ribozimi devono agire all’interno delle cellule bersaglio per espletare la loro funzione.